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Efecto de Tacrolimus® y Ciclosporina A sobre la Expresión de Glicoproteína P en Células Tubulares Renales en Cultivo.

Comentarios
[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

Resultados

 

Expresión de Glicoproteína P en Condiciones Basales

En condiciones basales los valores de %POS y el IMFE de gp-P fueron similares para las líneas de túbulo renal (%POS MDCK: 83.65±22.71; IMFE MDCK: 22.6±2.1) (%POS LLC-PK1: 81.28±20.5; IMFE LLC-PK1: 27.9±5.1) y muy superiores en la línea control transfectada NIH-MDR-G185 (%POS: 99±0.1%; IMFE: 122.8±15.4). (Tabla 3).

 

Efecto de los Inmunosupresores en la Expresión de Glicoproteína P

La incubación con los IS modificó el valor de IMFE para la gp-P en ambas líneas (ANOVA, p<0.001), siendo desde los 7 días para la línea MDCK y a partir de los 15 días en la línea LLC-PK1. La mayor inducción la proporcionó AZA seguido por CsA y FK506. Así tras quince días de tratamiento para las dos líneas se mantuvo la inducción de gp-P frente a los cultivos control (ANOVA, p<0.01) excepto para FK506 que perdió la significación estadística. Comparando FK506 con CsA, esta última induce mayor expresión de gp-P de forma estadísticante significativa (Newman-Keuls, p<0.05) en las líneas de túbulo renal y en los dos tiempos analizados. (Tabla 3).

 

Efecto de los Inmunosupresores sobre el Ciclo Celular de MDCK

Los inmunosupresores modifican el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo (ANOVA, p<0.001), esta diferencia también se encuentra cuando se analizan los ensayos a 7 y 15 días por separado (AN1, p<0.001), no existiendo prácticamente diferencias entre ambos tiempos evaluados (t-student, NS). Es AZA la que mayor cambio condiciona con disminución del porcentaje de células en G0/G1, gran aumento de células en S y fundamentalmente en G2/M con referencia a su control (N-K, p<0.01) y al resto de los inmunosupresores ensayados (N-K, p<0.01). Esta diferencia también se mantiene e incrememta a los 15 días (N-K, p<0.01). CsA y FK506 presentan un efecto proliferativo similar principalmente con un incremento significativo de FC de forma mantenida después de 15 días de incubación (N-K, p<0.01). (Tablas 4 y 5)

 

Efecto de los Inmunosupresores sobre el Ciclo Celular de LLC-PK1

Los inmunosupresores influyen en el porcentaje de células en las distintas fases del ciclo celular (ANOVA, p<0.001), esta diferencia también se detecta cuando se analizan los ensayos para los tiempos 7 y 15 días por separado (ANOVA, p<0.001), no existiendo diferencia significativa entre ambos tiempos (t-student, NS). La mayor significación la alcanzan AZA y CsA (Newman-Keuls, p<0.01), en el estudio de las modificaciones del ciclo a los dos tiempos ensayados, 7 y 15 días, para estos dos fármacos se producen diferencias significativas para ambos tiempos (Newman-Keuls, p<0.01), no van a existir diferencias significativas para ambos tratamientos entre las dos duraciones ensayadas (t-student, NS). FK506 también provoca una modificación en las distintas fases pero en menor medida (Newman-Keuls, p<0.05), cuando se estudian los ensayos de los diferentes tiempos, 7 y 15 días, por separado este efecto no se hace significativo (Newman-Keuls, NS) y no existen diferencias significativas para ambos tratamientos entre las dos duraciones ensayadas (t-student, NS). (Tablas 6 y 7).

 

Ensayo Funcional de la Glicoproteína P

En la línea transfectada NIH-MDR-G185 los ensayos con Rh123 ponen de manifiesto el efecto modulador de los IS sobre la gp-P. FK506 y CsA producen, de forma significativa, mayor acúmulo intracelular de Rh123 con referencia al bloqueante Verapamil y AZA es la que menor acumulo produjo; el efecto modulador es menos evidente en las líneas tubulares. (Tabla 8).

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Tabla 3. Efecto de los inmunosupresores en la expresión de glicoproteína-P, medido por variación de la incorporación media de fluorescencia específica (IMFE), en las líneas renales MDCK y LLC-PK1 tras 7 y 15 días de incubación farmacológica.

Fármacos

(IC70)

MDCK

(IMFE)

LLC-PK1

(IMFE)

7 días

15 días

7 días†

15 días
Control

22.68±2.14*

27.70±4.09§

35.44±8.40

27.98±5.16§
AZA

39.98±3.08

53.97±3.27

34.40±3.09

45.13±7.40
CsA

34.63±3.13

37.40±3.83

37.03±5.72

40.23±3.94
FK506

38.67±4.67

30.70±0.76

34.73±4.80

27.60±2.86

IC70: concenteración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 70%; IMFE: incorporación media de fluorescencia específica; 7 días: tiempo de incubación con fármacos de 6 días; 15 días: tiempo de incubación con fármacos de 14 días; Control: células no tratadas farmacológicamente; AZA: células tratadas con Azatioprina a una dosis de IC70; CsA: células tratadas con Ciclosporina A a una dosis de IC70; FK506: células tratadas con Tacrolimus® a una dosis de IC70.Valores expresados como media±s de un mínimo de tres experiencias independientes; *: Newman-Keuls p<0.01 de control vs todos; §: Newman-Keuls p<0.01 de control vs CsA y AZA; †: ANOVA no significativo.

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Tabla 4. Línea de túbulo contorneado distal MDCK. Distribución celular en las diferentes fases del ciclo en ensayos a 7 días.

Fármacos

(IC70)

MDCK

7 días

G0/G1

S

G2/M

FC
Control

83.01±6.13

14.03±6.12

2.93±1.14

16.96±6.10
AZA

32.02±6.54

30.20±13.72

37.43±18.09

68.13±6.37
CsA

71.04±5.62

21.88±3.54

7.06±3.18

28.94±5.61
FK506

71.98±7.65

21.85±5.80

6.20±1.92

28.05±7.52

IC70: concenteración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 70%; 7 días: tiempo de incubación con fármacos de 6 días; G0/G1, S, G2/M y FC=S+G2/M: fases del ciclo celular; Control: células no tratadas farmacológicamente; AZA: células tratadas con Azatioprina a una dosis de IC70; CsA: células tratadas con Ciclosporina A a una dosis de IC70; FK506: células tratadas con Tacrolimus® a una dosis de IC70.Valores expresados como media±s de un mínimo de tres experiencias independientes.

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Tabla 5. Línea de túbulo contorneado distal MDCK. Distribución celular en las diferentes fases del ciclo en ensayos a 15 días.

Fármacos

(IC70)

MDCK

15 días

G0/G1

S

G2/M

FC
Control

88.75±7.16

8.98±7.14

2.25±1.03

11.23±7.19
AZA

21.80±11.28

27.74±6.53

50.62±6.35

78.36±11.23
CsA

75.12±10.89

22.50±10.55

2.36±0.59

24.86±10.86
FK506

77.73±1.71

19.10±1.44

3.23±0.44

22.33±1.69

IC70: concenteración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 70%; 15 días: tiempo de incubación con fármacos de 14 días G0/G1, S, G2/M y FC=S+G2/M: fases del ciclo celular; Control: células no tratadas farmacológicamente; AZA: células tratadas con Azatioprina a una dosis de IC70 ; CsA: células tratadas con Ciclosporina A a una dosis de IC70; FK506: células tratadas con Tacrolimus® a una dosis de IC70.Valores expresados como media±s de un mínimo de tres experiencias independientes.

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Tabla 6. Línea de túbulo contorneado proximal LLC-PK1. Distribución celular en las diferentes fases del ciclo en ensayos a 7 días.

Fármacos

(IC70)

LLC-PK1

7 días

G0/G1

S

G2/M

FC
Control

81.75±6.45

15.82±5.59

2.57±1.03

18.38±6.58
AZA

40.48±11.89

38.42±5.01

21.08±8.42

59.50±11.83
CsA

62.92±3.01

27.26±2.73

9.86±3.24

37.12±3.00
FK506

74.05±5.08

23.10±4.60

2.93±1.91

26.03±5.11

IC70: concenteración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 70%; 7 días: tiempo de incubación con fármacos de 6 días; G0/G1, S, G2/M y FC=S+G2/M: fases del ciclo celular; Control: células no tratadas farmacológicamente; AZA: células tratadas con Azatioprina a una dosis de IC70; CsA: células tratadas con Ciclosporina A a una dosis de IC70; FK506: células tratadas con Tacrolimus® a una dosis de IC70.Valores expresados como media±s de un mínimo de tres experiencias independientes.

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Tabla 7. Línea de túbulo contorneado proximal LLC-PK1. Distribución celular en las diferentes fases del ciclo en ensayos a 15 días.

Fármacos

(IC70)

LLC-PK1

15 días

G0/G1

S

G2/M

FC
Control

83.62±3.06

13.12±3.03

3.30±0.86

16.42±3.03
AZA

26.00±6.94

31.95±7.97

42.18±13.47

74.13±6.82
CsA

62.35±9.00

20.00±7.66

17.70±9.70

37.70±9.03
FK506

76.95±5.98

20.43±5.68

2.63±0.64

23.05±5.87

IC70: concenteración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 70%; 15 días: tiempo de incubación con fármacos de 14 días G0/G1, S, G2/M y FC=S+G2/M: fases del ciclo celular; Control: células no tratadas farmacológicamente; AZA: células tratadas con Azatioprina a una dosis de IC70; CsA: células tratadas con Ciclosporina A a una dosis de IC70; FK506: células tratadas con Tacrolimus® a una dosis de IC70.Valores expresados como media±s de un mínimo de tres experiencias independientes.

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Tabla 8. Ensayo funcional de la glicoproteína-P con Rodamina123 (Rh123) sobre la línea fibroblastica NIH-MDR-G185 y ensayo funcional de la glicoproteína-P con Rh123 sobre las líneas renales MDCK y LLC-PK1 tras 7 y 15 días de incubación farmacológica.

Fármacos

(30mM)

 

NIH-MDR-G185

(CMF)

Fármacos

(IC70)

MDCK

(CMF)

LLC-PK1

(CMF)

Verapamil

120.4

7 días

15 días

7 días

15 días

Control

17.8

 Control

155.2

114.5

134.5

148.6

AZA

21.2

 AZA

181.8

136.2

217.9

127.9

CsA

155.9

 CsA

81.5

124.0

165.3

144.8

FK506

153.9

 FK506

99.5

137.5

164.3

130.2

CMF: canal medio de fluorescencia; Verapamil: células con Rh123 y verapamil 30mM; Control: células con Rh123; AZA: células con Rh123 y Azatiprina 30mM; CsA: células con Rh123 y CsA 30mM; FK506: células con Rh123 y Tacrolimus® 30 mM.

CMF: canal medio de fluorescencia; 7 días: tiempo de incubación con fármacos de 6 días; 15 días: tiempo de incubación con fármacos de 14 días; Control: células no tratadas farmacológicamente; AZA: células tratadas con Azatioprina a una dosis de IC70; CsA: células tratadas con Ciclosporina A a una dosis de IC70; FK506: células tratadas con Tacrolimus® a una dosis de IC70.
  

[Título] [Introducción] [Material y Métodos] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

Francisco Arrebola, MS.
Copyright © 1996, Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Hospital Universitario, Universidad de Granada, 18012 Granada, España. Reservados todos los derechos.