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Nº 048
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[Introducción] [Material y Métodos] [Resultados] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]
Francisco Arrebola, Francisco O'Valle, Asunción Olmo, Mariano Aguilar, Marco Masseroli, Mª Eugenia Reguero, Francisco Revelles, Rafael Carvia, Marina Higueras, Belén Espigares, Raimundo G. Del Moral.
Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Hospital Universitario, Universidad de Granada, Granada, España
Dpto. de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Avda. de Madrid 11 - 18012 Granada, ESPAÑA
INTRODUCCIÓN: La glicoproteína P (gp-P) es fuertemente expresada en el borde apical de los túbulos contorneados proximales y se detecta en líneas celulares en cultivo, procedentes de los mismos. La función fisiológica exacta de gp-P en el riñón no está totalmente definida, existen evidencias de que juega un papel importante en los mecanismos detoxicantes renales cuando se produce una agresión por xenobióticos actuando como aspirador de moléculas hidrofóbicas. Nuestro grupo ha demostrado en biopsias de trasplante renal, la relación entre los depósitos intrarrenales de Ciclosporina A (CsA) y el incremento en la expresión de gp-P. Este mismo fenómeno lo hemos constatado con líneas celulares de túbulo renal. Alternativamente, la CsA puede actuar bloqueando funcionalmente a la gp-P. Presentamos el estudio comparativo del efecto in vitro de tres inmunosupresores (IS) sobre la modulación de la expresión de gp-P y su capacidad funcional.
MATERIAL Y MÉTODOS: Los ensayos in vitro se han realizado con las líneas celulares de túbulo renal MDCK y LLC-PK1 mantenidas en medio de cultivo MEM más 5% de SBFI y con la línea celular NIH-MDR-G185 transfectada con el gen mdr1 humano e incubada con DMEM más 10% de SBFI. La inducción farmacológica se ha llevado a cabo con dosis subletales (IC70) de los IS: CsA (1.85µM y 10µM), Tacrolimus® (FK506) (10µM), Azatioprina (AZA) (105µM y 207µM), siendo los tiempos de incubación con los fármacos 7 y 15 días. Se han valorado mediante citometría de flujo los siguientes parámetros: expresión de gp-P (AcMo JSB-1); número de células positivas (%POS); incorporación media de fluorescencia específica (IMFE); ciclo celular y estimación de la fracción de crecimiento (FC); inducción o bloqueo funcional de la gp-P usando como sustrato un colorante fluorescente, Rodamina 123 (Rh123), y determinando el canal medio de fluorescencia (CMF).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN: En condiciones basales el %POS y la intensidad de expresión de gp-P medida en IMFE fue similar para las líneas de túbulo renal (%POS MDCK: 83.65±22.71 y LLC-PK1: 81.28±20.5) (IMFE MDCK: 22.6±2.1 y LLC-PK1: 27.9±5.1) y muy superior en la línea control transfectada NIH-MDR-G185 (%POS: 99±0.1% IMFE: 122.8±15.4). La incubación con los IS modificó el IMFE en ambas líneas (ANOVA, p<0.001), siendo desde los 7 días para la línea MDCK y a partir de los 15 días en la línea LLC-PK1. Como se ve en la siguiente tabla, la mayor inducción la proporcionó la AZA seguido por la CsA y FK506.
Fármacos (IC70) |
MDCK (IMFE) |
LLC-PK1 (IMFE) |
||
7 días |
15 días |
7 días† |
15 días |
|
| Control | 22.68±2.14* |
27.7±4.09§ |
35.44±8.4 |
27.98±5.16§ |
| AZA | 39.98±3.08 |
53.97±3.27 |
34.4±3.09 |
45.13±7.4 |
| CsA | 34.63±3.13 |
37.4±3.83 |
37.03±5.72 |
40.23±3.94 |
| FK506 | 38.67±4.67 |
30.7±0.76 |
34.73±4.8 |
27.6±2.86 |
Valores expresados como media±s; *: Newman-Keuls p<0.01 de control vs todos; §: Newman-Keuls p<0.01 de control vs CsA y AZA; †: ANOVA no significativo. |
||||
Así tras quince días de tratamiento para las dos líneas se mantuvo la inducción de gp-P frente a los cultivos control (ANOVA, p<0.01) excepto para FK506 que perdería la significación estadística. Comparando FK506 con CsA, esta última induce mayor expresión de gp-P de forma estadísticamente significativa (Newman-Keuls, p<0.05) en las líneas de túbulo renal y en los dos tiempos analizados. En la línea transfectada NIH-MDR-G185 los ensayos con Rh123 pusieron de manifiesto el efecto modulador de los IS sobre la gp-P. FK506 y CsA produjeron de forma significativa un mayor acúmulo intracelular de Rh123 con referencia al bloqueante Verapamil, y AZA que fue la que menos produjo. Como se ve en la siguiente tabla, para las líneas tubulares el efecto modulador de los IS sobre la gp-P fue menos evidente.
Fármacos (30mM)
|
NIH-MDR-G185 (CMF) |
Fármacos (30mM) |
MDCK (CMF) |
LLC-PK1 (CMF) |
|||
Verapamil |
120.4 |
7 días |
15 días |
7 días |
15 días |
||
Control |
17.8 |
Control | 155.2 |
114.5 |
134.5 |
148.6 |
|
AZA |
21.2 |
AZA | 181.8 |
136.2 |
217.9 |
127.9 |
|
CsA |
155.9 |
CsA | 81.5 |
124.0 |
165.3 |
144.8 |
|
FK506 |
153.9 |
FK506 | 99.5 |
137.5 |
164.3 |
130.2 |
|
CONCLUSIONES: 1) In vitro los fármacos con potencial nefrotóxico inducen la sobreexpresión de gp-P tras incubación prolongada. 2) El FK506 comparativamente induce menor expresión de gp-P y simultáneamente conduce al bloqueo funcional de esta molécula de forma significativa; esta doble acción estimuladora y bloqueante, puede ser de gran aplicación en el manejo terapéutico de los enfermos transplantados.
Palabras claves
: Nefrotoxicidad, Cultivo tisular, Glicoproteína-P, FK506, Ciclosporina A, Azatioprina, Rodamina 123.
| Francisco
Arrebola es Becario Predoctoral del Ministerio de Educación y Cultura Español en el Departamento de Anatomía Patológica de
la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada. Su principal línea de
Investigación es el estudio de la nefrotoxicidad farmacológica y su relación con la
multirresistencia a fármacos en modelos experimentales in vitro.
Os esperamos en el XXII Curso Anual de Patología Quirúrgica de las Enfermedades Neoplásicas impartido por el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center y organizado en Granada (mayo de 1999). |
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