Comunicación
      Nº 012

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IndiceIndice

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[Título] [Introducción] [Resultados] [Discusión] [Iconografía] [Bibliografía]

Material y Métodos

 

Material Histológico

Se han estudiado un total de 23 biopsias renales pertenecientes a enfermos diagnosticados de DMID (15 sin EAU - DMIDNA - y 8 con EAU - DMIDA -) junto con 8 biopsias renales de control obtenidas de riñones de donantes, en el transcurso de la valoración previa antes de ser injertados. Todas las muestras procedían del Servicio de Nefrología del Hospital Universitario J. Trueta de Girona.

 

Métodos Histopatológicos

Los cilindros renales fueron fijados en formalina tamponada e incluidos en parafina. Las secciones para el examen histopatológico fueron teñidas con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson-Goldner y ácido periódico de Schiff (PAS). Las preparaciones fueron examinadas por dos experimentados nefropatólogos que evaluaron la presencia de hialinosis arteriolar, atrofia tubular, fibrosis intersticial y glomeruloesclerosis nodular o difusa. Para la valoración morfométrica fue empleada la tinción de rojo Sirio, siguiendo el método propuesto por nuestro grupo9. Todos los cilindros de corteza renal contenían al menos 10 glomérulos.

 

Método Inmunohistoquímico

Fue utilizado un cóctel de anticuerpos monoclonales frente a colágena tipo IV que reaccionan con la colágena tipo IV de origen humano, a dilución de 1:25 (clonas 6/17, Master Diagnóstica S.A., Granada, España). La inmunotinción para colágena IV fue realizada con un kit estándar polivalente de estreptavidina-biotina-fosfatasa alcalina (Master Diagnóstica S.A., Granada, España). Todas las secciones una vez desparafinadas fueron sometidas simultáneamente a desenmascaramiento antigénico con horno microondas durante 15 min a 700 watt e introducidas en tampón citrato 0.1 M (pH 6.0). El revelado también fue realizado simultáneamente para todos los cortes tisulares con fast red (Master Diagnóstica S.A., Granada, España) controlando bajo visión microscópica la aparición del precipitado rojo característico. El tiempo de revelado fue de 8 minutos. No se realizó tinción de contraste para facilitar su cuantificación.

 

Cuantificación Morfométrica

Para cuantificar la fibrosis intersticial, las preparaciones histológicas fueron examinadas automáticamente por análisis digital de imagen. El análisis de imagen fue realizado tanto para las secciones teñidas con rojo Sirio como las inmunoteñidas para colágena IV. Ya que la esclerosis en la corteza renal tiene una distribución irregular, imágenes con glomérulos (áreas de fibrosis periglomerular) fueron cuantificadas separadamente de las imágenes que contenían sólo túbulos e intersticio. Estas imágenes fueron seleccionadas principalmente de las áreas con más expansión intersticial. Las áreas peritubulares y periglomerulares fueron analizadas en 20 campos microscópicos. Sólo los glomérulos completos fueron valorados. Las imágenes fueron capturadas usando una vídeo cámara BCD-700 CCD Vidamax, conectada a un microscopio BH-2 Olympus (con aumento de 200X), en una escala de 256 niveles de gris (blanco y negro) y fueron procesadas con la aplicación de análisis digital de imagen, Fibrosis HR® (Master Diagnóstica S.A., Granada, España), realizada en ambiente Windows (Microsoft, Redmond, WA). El programa Fibrosis HR® extrae automáticamente las membranas basales y el tejido conectivo teñido con rojo Sirio, eliminando el fondo de tinción ("background") de células tubulares o estructuras nucleares y extrae el área glomerular de acuerdo con un algoritmo que identifica el espacio urinífero glomerular. Cuando había zonas de contacto entre el flóculo y la cápsula de Bowman, fue ocasionalmente necesario separarlas en la imagen mediante una opción interactiva del programa. Los resultados fueron expresados como porcentajes de fibrosis relativa al área de la imagen después de substraer el área glomerular eventualmente presente y como valores absolutos en µm². Este método produce una exacta cuantificación automática de la fibrosis peritubular y periglomerular así como de la morfometría glomerular9. Este mismo procedimiento fue seguido para cuantificar las secciones inmunoteñidas con colágena IV.

 


Francisco O'Valle, MD.
Copyright © 1996, Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina y Hospital Universitario, Universidad de Granada, 18012 Granada, España. Reservados todos los derechos.