Póster
Nº 004
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Muñiz, E.(1), Rodríguez-Mateo, L.(1), Martínez-Rodríguez, R. (2) y Gragera, R.R.(3)
(1) Departamento de Biología Celular. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. España. (2) Servicio de Anatomía Patológica. C.I.C. Carlos III. c/ Sinesio Delgado, 10. 28029 Madrid. España. (3) Departamento de Ciencias Morfológicas y Cirugía. Facultad de Medicina. Universidad de Alcalá de Alcalá de Henares. Madrid. España.
Departamento de Bilogía Celular. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid. 28040 Madrid. España.
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El propósito del presente estudio es demostrar la utilidad de un nuevo fijador químico llamado COMPLUCAD (COMPLUCAD S.A. Lab., ESPAÑA; P9500471) en técnicas inmunohistoquímicas.
En el presente estudio se utilizaron 12 ratas Wistar adultas (250g) mantenidas en óptimas condiciones. Los animales fueron anestesiados con Equitesín (60 mg/kg) (JAnsen Lab., USA) y perfundidas transcardialmente con una solución al 10% (v/v) de COMPLUCAD en etanol (70%, v/v), ajustando cuidadosamente el pH de la solución. Las muestras histológicas se fijaron 82,4,6,8,12 y 24 horas) a 4ºC. Posteriormente se deshidrataron en una serie alcohólica creciente (comenzando con el alcohol de 70%). Se incluyeron en parafina y los cortes histológicos obtenidos se procesaron siguiendo el método inmunohistoquímico del PAP (Sterberger, 1979) para la demostración inmunohistoquímica de diversas proteínas del citoesqueleto. Los cortes se rehidrataron y lavaron con PBS durante 15 min. Posteriormente fueron tratados con 0.3% (v/v) de agua oxigenada diluída en agua destilada durante 30 minutos, con el fin de inhibir la peroxidasa endógena y lavados con PBS (30 min.). A continuación se trataron con 0.5M L-lisina (Sigma Chem. Co.) (2h a temperatura ambiente) y lavados con PBS (45 minutos). Posteriormente se incubaron en agitación durante 2h a temperatura ambiente en el suero normal de cabra (Sigma Chem. Co.) diluído en PBS (1:1). A continuación se incubaron los cortes en agitación a 4ºC en los siguientes antisueros monoclonales específicos desarrollados en ratón y diluídos en PBS: anti-citoqueratina (1:20), anti-vimentina (1:40), anti-laminina (1:1.000) y anti-desmina (1:20), todos ellos suministrados por Sigma Chem. Co. Tras diversos lavados en PBS, los cortes se incubaron a temperatura ambiente durante 2h en el suero normal de ratón (Sigma Cham. Co.) desarrollado en cabra diluído en PBS(1:70). Después de repetidos lavados en PBS se incubaron en el complejo PAP desarrollado en ratón (1:500 en PBS; Sigma Chem. Co.). Tras repetidos lavados en PBS, la peroxidasa se reveló utilizando 0.5 mg/ml de 3,3´-DAB (Sigma Chem. Co.) y 0.001% (v/v) de agua oxigenada disueltos en tampón Tris-HCl (pH=7.4, a temperatura ambiente). Posteriormente las muestras histológicas fueron deshidratadas, montadas en DePeX y observadas a microscopio óptico. Paralelamente se llevaron a cabo los controles negativos de la reacción inmunohistoquímica, que implicaron el uso del suero normal de cabra sustituyendo al específico y la omisión del antisuero primario.
Los resultados han demostrado que incluso con fijaciones cortas de 2 h, el COMPLUCAD proporciona una excelente fijación, preservando la antigenicidad de los tejidos. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos realizados.
El presente estudio es una primera aproximación a la utilización del COMPLUCAD en las técnicas inmunohistoquímicas.
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