Nº 769. Foro técnico
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Importancia del desenmascaramiento antigénico en las técnicas de inmunohistoquímica Francisco Borja Gutierrez Corres (TEAP)[1], Consuelo Del Campo Clemente (TEAP)[1], Elisa Cuero Ruiz (TEAP)[1] |
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Introducción:
La inmunohistoquimica consiste en marcar componentes químicos de muy diversa naturaleza en los tejidos y células mediante el fundamento teórico de la utilización de la propiedad de unión específica entre un antigeno y un anticuerpo, por lo tanto la inmunohistoquimica tiene como objetivo la identificación, localización y cuantificación de estos antigenos.
La inmunotinción de los tejidos es un proceso largo y complicado que depende de numerosos factores que incluyen muchos pasos en el proceso, siendo cada uno de ellos un posible punto de error. Pero nosotros no vamos a centrar en el desenmascaramiento antigénico o recuperación antigénica.
Al conocer estos efectos, podemos determinar que los principios de actuación de un sistema de recuperación antigénica debe de: Romper los enlaces cruzados y restaurar la conformación del antigeno.
Los métodos utilizados para el desenmascaramiento antigénico son:
-Digestión proteolotico.
-Calor
-Deslipidización (Cloroformo)
Material y métodos
Emplearemos esto metodos de recuperecion antigénica:
-Digestión antigénica por la enzima Proteasa K
-Digestión antigénica por calor con olla a presión.
-Digestión antigénica por calor con baño húmedo termo estático.
-Digestión antigénica por calor automatizada por Modulo PT.
Conclusiones:
El desenmascaramiento antigénico consiste en eliminar o romper los enlaces que se han producido durante el proceso de fijación con aldehídos (formol, glutaraldehido.), es un método fácil de realizar pero hay que tener en cuenta una serie de recomendaciones.
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La inmunohistoquimica consiste en marcar componentes químicos de muy diversa naturaleza en los tejidos y células mediante el fundamento teórico de la utilización de la propiedad de unión específica entre un antigeno y un anticuerpo (reacciones antigeno-anticuerpo), por lo tanto la inmunohistoquimica tiene como objetivo la identificación, localización y cuantificación de estos antigenos.
La inmunotinción de los tejidos es un proceso largo y complicado que depende de numerosos factores que incluyen muchos pasos en el proceso, siendo cada uno de ellos un posible punto de error. Pero nosotros no vamos a centrar en el desenmascaramiento antigénico o recuperación antigénica.
La utilización de fijadores que actúan mediante enlaces cruzados entre los que se encuentra el formol, ya que transforma u oculta los epitopos y por este efecto los anticuerpos primarios no pueden unirse a ellos.
Esta perdida de antigenidad ocasionada por los fijadores que contiene aldehídos, obliga en la mayoría de los casos a recuperar los epitopos antigénicos que pueden quedar enmascarados por dichos enlaces.
Al conocer estos efectos, podemos determinar que los principios de actuación de un sistema de recuperación antigénica debe de: Romper los enlaces cruzados y restaurar la conformación del antigeno.
Los métodos utilizados para el desenmascaramiento antigénico son:
-Digestión proteolotico.
-Calor
-Deslipidización (Cloroformo)
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Digestión antigénica por la enzima Proteasa K
Material:
-Cámara húmeda.
-Proteasa K (Proteasa k-dako) 40X
-Sustrato de la proteasa k (proteinasa K diluent-Dako)
Protocolo:
Se añade a 1.6 ml. de sustrato de la proteasa K y 1 Gota de proteasa K para un portaobjetos previamente desparafinado e hidratado y se incuban de 5 a 10 minutos. Después se lava el portaobjetos en agua destilada.
Ventajas:
-Esta técnica es útil si se va a utilizar anticuerpos como el CMV (citomegalovirus), anticuerpos convenientes que su temperatura se eleve demasiado para impedir la pérdida de antigenidad.
Inconvenientes:
-Se puede perder la morfología del tejido o desprendimiento de este.
-No es reproducible para todos los tipos de antigenos.
Digestión antigénica por calor con olla a presión.
Material:
-Olla a presión.
-Hornillo.
-Gradilla para portaobjetos.
-Solución recuperadora de antigenos 10X (Target retieval solution-Citrate buffer Ph 6.0-Dako)
Protocolo:
Se prepara 1.5 de solución recuperadora de antigenos a 10X, y se introduce en la olla.
Esta se pone a calentar en el hornillo y cuando la solución llega al punto de ebullición se introduce la gradilla con los cristales que han sido previamente desparafinados y hidratados. Se cierra la tapa y se espera a que el indicador de presión de la olla suba hasta la segunda muesca, desde Este momento se contara 3 minutos. Después se retira del hornillo y se abrirá la tapa de la olla cuando este fría. Puede ser ayudado introduciendo la olla en un chorro de agua corriente.
Cuando finalice el proceso la gradilla con los portaobjetos se introducirá en un baño de agua destilada.
Ventajas.
-Resultados homogéneos pues la temperatura es constante.
-No problemas de desecación puesto que no hay evaporación.
-Mayor capacidad para tratar mayor numero de preparaciones al mismo tiempo.
-menor tiempo del calentamiento del tejido.
Inconvenientes:
-Costo de la olla a presión.
-Control del tiempo de ebullición de la solución.
-Precaución cuando se manipule ala olla caliente.
Digestión antigénica por calor con baño húmedo termo estático
Material:
-Baño húmedo termostatico.
-Termómetro.
-Coplín de cristal.
-Solución recuperadora antigénica 10x (Epitope retriecal solution-Tampon de citrato0.1 mol/L con agente antimicrobiano-Dako).
Protocolo:
Preparamos 100 ml de solución recuperadora antigénica e introducir en un coplín. El baño termostatito se llena de agua destilada sin sobrepasar más de 2/3 la altura del coplín. El coplín con la solución de desenmascaramiento, se mete en el baño termostatito este programa 95-98ºC.
Por medio del termómetro que se introducirá en el copli que contiene la solución de desenmascaramiento, sabremos la temperatura que se va alcanzando y cuando esta llegue a alcanzar los 95-98 ºC, se introducirán los portaobjetos previamente desparafinados e hidratados y allí permanecerán de 30-40 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se sacara el coplín con los portaobjetos y se dejara enfriar durante 20 minutos, después los portaobjetos pasaran a un baño de agua destilada.
Ventajas:
-Disponibilidad del material en la mayoría de los laboratorios.
-La reposición de la perdida del tampón de recuperación antigénica no es necesaria mientras la solución se mantenga bajo el punto de ebullición.
Inconvenientes:
-Capacidad limitada de portaobjetos.
-Control exhaustivo de la temperatura.
-Precaución cuando se manipule el baño en funcionamiento.
Digestión antigénica por calor automatizada por Modulo PT.
Material:
-Modulo PT (Lab Visión).
-Solución recuperadora antigénica 10x.(PT module buffer EDTA 10X Ph 8.0 Lab Visión)
-Gradilla portaobjetos.
Protocolo:
Se prepara 1.5 litros de solución de recuperación antigénica 10X, se introduce en la cubeta que ya esta preparada en el modulo PT. Los portaobjetos sin depesparafinar e hidratar se colocan en la gradilla portaobjetos, y se meten en el Modulo PT, se cierra la maquina y se programa.
Después de que la maquina allá terminado saltara un dispositivo sonoro y luminoso. Se abre la tapa y se retira la gradilla con los portaobjetos, después se colocara en un baño con agua caliente corriente.
Ventajas:
-Desparafina e hidrata las muestras.
-Resultados homogéneos pues la temperatura es constante.
-No problemas de desecación puesto que no hay evaporación.
-Mayor capacidad para tratar mayor numero de preparaciones al mismo tiempo.
-Menor tiempo del calentamiento del tejido.
-Este método ha reemplazado a la olla a presión
Inconvenientes:
-Costo del Modulo PT.
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El desenmascaramiento antigénico consiste en eliminar o romper los enlaces que se han producido durante el proceso de fijación con aldehídos (formol, glutaraldehido.), es un método fácil de realizar pero hay que tener en cuenta una serie de recomendaciones:
-Si el desenmascaramiento antigénico no se realiza es una causa de falso negativo.
-Si la fijación ha sido excesiva puede producir un enmascaramiento irreversible de los antigenos.
-La recuperación enzimática solo un grupo reducido de anticuerpos se benefician de este método y hay que adaptar la concentración de la encima, el ph y la temperatura y el tiempo de actuación. Si la muestra esta sobre digerida reducir la concentración de la enzima y el tiempo de recuperación.
-Como control de las técnicas para el desenmascaramiento antigénico por calor se puede utilizar una amígdala fijada en formol y le realizaremos un Ki 67 de la manera convencional del laboratorio. El patrón debe de ser positividad en los núcleos del centro germinal, positividad en las células de los espacios ínter foliculares, positividad en algunas células endolteliares y positividad en las células básales de los epitelios, y por supuesto en todas las mitosis.
Si esto no ocurre:
-Ausencia de inmunotinción controlar el método de desenmascaramiento.
-Si es débil, aumentar el tiempo de desenmascaramiento.
-Si se desprende la pieza controlar la temperatura.
-Existen algunos epitopos que se pueden beneficiar de una recuperación antigénica combinada de calor y digestión enzimática, cuando el empleo por si solo no es suficiente. (CD4, TdT…etc.).
-Se deben emplear portas pretratados para evitar que se desprenda el tejido.
-Para obtener resultados en la tinción es importante tener en cuenta dos factores el PH y la molaridad
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1 -Laboratorio de anatomía patológica. Raimundo García del Moral. Editorial Interamericana McGraw-Hill. 2 -Dorland diccionario enciclopédico ilustrado de medicina. 20 ediciones. Editorial Interamericana McGraw-Hill. 3 -Exámenes de laboratorio, técnicas microscópicas. C. Nezelof, P. Galle, N. Hinglais. Editorial Jims. 4 -Instituto de patología de las fuerzas armadas de los estados unidos de América (AFIP), Métodos Histotecniologicos. Washington D.C. 1995.
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- ISABEL MARIA BROWN DURRUTHY (09/05/2007 8:48:13)
- JULIO CESAR LESCANO SORIANO (09/05/2007 23:13:41)
- FRANCISCO BORJA GUTIERREZ CORRES (14/05/2007 11:52:22)
- Mileidys Pérez Gutiérrez (18/05/2007 6:15:03)
- FRANCISCO BORJA GUTIERREZ CORRES (18/05/2007 11:21:40)
- Zulema Ramirez Carmenate (22/05/2007 15:04:23)
- Dania Ledesma (23/05/2007 7:12:21)
- Irina hernandez Melendi (24/05/2007 15:53:11)
- JOAQUINA CAPELLAN GÜEMES (26/05/2007 20:33:00)
- FRANCISCO BORJA GUTIERREZ CORRES (28/05/2007 10:14:17)
- Mirta Garcia Jardon (04/06/2007 9:33:50)
- ELIXABETE FUENTES GUTIÉRREZ (30/06/2007 12:16:12)
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