Material y Métodos
Digestión antigénica por la enzima Proteasa K
Material:
-Cámara húmeda.
-Proteasa K (Proteasa k-dako) 40X
-Sustrato de la proteasa k (proteinasa K diluent-Dako)
Protocolo:
Se añade a 1.6 ml. de sustrato de la proteasa K y 1 Gota de proteasa K para un portaobjetos previamente desparafinado e hidratado y se incuban de 5 a 10 minutos. Después se lava el portaobjetos en agua destilada.
Ventajas:
-Esta técnica es útil si se va a utilizar anticuerpos como el CMV (citomegalovirus), anticuerpos convenientes que su temperatura se eleve demasiado para impedir la pérdida de antigenidad.
Inconvenientes:
-Se puede perder la morfología del tejido o desprendimiento de este.
-No es reproducible para todos los tipos de antigenos.
Digestión antigénica por calor con olla a presión.
Material:
-Olla a presión.
-Hornillo.
-Gradilla para portaobjetos.
-Solución recuperadora de antigenos 10X (Target retieval solution-Citrate buffer Ph 6.0-Dako)
Protocolo:
Se prepara 1.5 de solución recuperadora de antigenos a 10X, y se introduce en la olla.
Esta se pone a calentar en el hornillo y cuando la solución llega al punto de ebullición se introduce la gradilla con los cristales que han sido previamente desparafinados y hidratados. Se cierra la tapa y se espera a que el indicador de presión de la olla suba hasta la segunda muesca, desde Este momento se contara 3 minutos. Después se retira del hornillo y se abrirá la tapa de la olla cuando este fría. Puede ser ayudado introduciendo la olla en un chorro de agua corriente.
Cuando finalice el proceso la gradilla con los portaobjetos se introducirá en un baño de agua destilada.
Ventajas.
-Resultados homogéneos pues la temperatura es constante.
-No problemas de desecación puesto que no hay evaporación.
-Mayor capacidad para tratar mayor numero de preparaciones al mismo tiempo.
-menor tiempo del calentamiento del tejido.
Inconvenientes:
-Costo de la olla a presión.
-Control del tiempo de ebullición de la solución.
-Precaución cuando se manipule ala olla caliente.
Digestión antigénica por calor con baño húmedo termo estático
Material:
-Baño húmedo termostatico.
-Termómetro.
-Coplín de cristal.
-Solución recuperadora antigénica 10x (Epitope retriecal solution-Tampon de citrato0.1 mol/L con agente antimicrobiano-Dako).
Protocolo:
Preparamos 100 ml de solución recuperadora antigénica e introducir en un coplín. El baño termostatito se llena de agua destilada sin sobrepasar más de 2/3 la altura del coplín. El coplín con la solución de desenmascaramiento, se mete en el baño termostatito este programa 95-98ºC.
Por medio del termómetro que se introducirá en el copli que contiene la solución de desenmascaramiento, sabremos la temperatura que se va alcanzando y cuando esta llegue a alcanzar los 95-98 ºC, se introducirán los portaobjetos previamente desparafinados e hidratados y allí permanecerán de 30-40 minutos. Una vez transcurrido este tiempo se sacara el coplín con los portaobjetos y se dejara enfriar durante 20 minutos, después los portaobjetos pasaran a un baño de agua destilada.
Ventajas:
-Disponibilidad del material en la mayoría de los laboratorios.
-La reposición de la perdida del tampón de recuperación antigénica no es necesaria mientras la solución se mantenga bajo el punto de ebullición.
Inconvenientes:
-Capacidad limitada de portaobjetos.
-Control exhaustivo de la temperatura.
-Precaución cuando se manipule el baño en funcionamiento.
Digestión antigénica por calor automatizada por Modulo PT.
Material:
-Modulo PT (Lab Visión).
-Solución recuperadora antigénica 10x.(PT module buffer EDTA 10X Ph 8.0 Lab Visión)
-Gradilla portaobjetos.
Protocolo:
Se prepara 1.5 litros de solución de recuperación antigénica 10X, se introduce en la cubeta que ya esta preparada en el modulo PT. Los portaobjetos sin depesparafinar e hidratar se colocan en la gradilla portaobjetos, y se meten en el Modulo PT, se cierra la maquina y se programa.
Después de que la maquina allá terminado saltara un dispositivo sonoro y luminoso. Se abre la tapa y se retira la gradilla con los portaobjetos, después se colocara en un baño con agua caliente corriente.
Ventajas:
-Desparafina e hidrata las muestras.
-Resultados homogéneos pues la temperatura es constante.
-No problemas de desecación puesto que no hay evaporación.
-Mayor capacidad para tratar mayor numero de preparaciones al mismo tiempo.
-Menor tiempo del calentamiento del tejido.
-Este método ha reemplazado a la olla a presión
Inconvenientes:
-Costo del Modulo PT.
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Baño humedo termostático - fiogf49gjkf0d Baño humedo termostático
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Modulo PT - fiogf49gjkf0d Modulo PT
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