9º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

Nº 974. Foro técnico

Direccion de contacto
Autopista Novia del Mediodía Km 6, Ciudad de la Habana, Cuba P.O.Box 601, Marianao 13 Telf:+53 (7) 202 0451 Fax:+.53 (7) 204 6051 E-mail: yaxsier@ipk.sld.cu

Comparación de los resultados de la aplicación de tres métodos de extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina

MSc Yaxsier De Armas^[1], Virginia Capó^[1], María Caridad López^[1], Ledys Xiomara López^[1], Lilian Mederos^[2], Raúl Díaz^[2]
(1) Departamento de Anatomía Patológica, Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK). CUBA
(2) Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones de Tuberculosis y Micobacterias del IPK. CUBA

Resumen

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La extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina (TEP) es un paso crítico en muchas técnicas moleculares. Varios han sido los protocolos empleados en la literatura para conseguir este propósito. En la presente investigación, se compararon los resultados de la aplicación de tres métodos de extracción de ADN de TEP para establecer el protocolo óptimo en nuestro laboratorio. El método de extracción de ADN que emplea la resina quelante Chelex-100 (Método B) demostró ser útil como método de rutina para lograr la extracción de ADN de TEP con calidad y cantidad suficiente en un menor tiempo. El método B es una buena opción para investigaciones en patología molecular.

Summary

The DNA extraction from paraffin-embedded tissue (PET) is a critical step in a lot of molecular techniques. Several protocols have been carried out for this objective in the literature. In the present study, it was compared the results of three DNA extraction methods performance from PET to established the optimal protocol in our laboratory. It was demonstrated Chelex-100 DNA extraction method (Method B), that uses quelant resin, is useful as a routine method for achieve DNA extraction from PET with enough quality and quantity in a shorter time. Method B is a good option in molecular pathology research.

Keywords: DNA extraction, paraffin, comparison methods, Mycobacterium tuberculosis, molecular pathology.

Los TEP archivados en los departamentos de Anatomía Patológica constituyen una valiosa fuente de material para realizar estudios retrospectivos en tejidos y representan un recurso invaluable para estudiar la patogenia molecular de las enfermedades.¹La mayoría de las muestras procesadas en los laboratorios de Patología son rutinariamente fijadas en formalina y embebidas en parafina. Esto permite conservar la arquitectura del tejido. Sin embargo, la extracción de ADN de calidad adecuada para estudios de biología molecular a partir de este material, es un problema significativo.²

En la última década se han publicado varios métodos para la extracción y purificación de ADN a partir de TEP. Algunos protocolos, por ejemplo, utilizan diferentes tiempos de incubación para el tratamiento proteolítico de las muestras³, otros emplean solventes orgánicos adicionales como fenol y cloroformo, antes de la precipitación con etanol.⁴Existen metodologías alternativas, que utilizan la lisis celular por calentamiento en agua destilada para procesar el tejido.⁵Por otra parte, el método utilizando Chelex -100 ha sido empleado con relativo éxito para obtener ADN.⁶En la literatura internacional se encuentran metodologías que utilizan la sonicación de la muestra y la posterior incubación de la misma en una solución con varios detergentes.⁷ Recientemente, otros autores han aplicado sistemas comerciales para la purificación de ADN en TEP.⁸

En este trabajo, se compararon tres métodos de extracción de ADN de TEP para establecer el protocolo óptimo que permita obtener cantidad suficiente de material genético con un mínimo de manipulación en un corto tiempo. Con esto se mejora la rapidez del diagnóstico en nuestro departamento de Anatomía Patológica.

De tres pacientes con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) fallecidos en el Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK), Ciudad de la Habana, Cuba se seleccionó un ganglio linfático de cada uno, según su aspecto macroscópico, para ser estudiado histológicamente y para cultivo bacteriológico.

Se utilizó una mitad de cada ganglio seleccionado para ser procesado para imbibición en parafina y estudio histológico. El estudio histológico permitió detectar la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes en las tres muestras seleccionadas.

La otra mitad de la muestra fue enviada para su estudio por cultivo bacteriológico en el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones de Tuberculosis y Micobacterias del IPK.

Para cada protocolo de extracción de ADN (Método A - C) seleccionado para testar su capacidad de extracción de ADN genómico, 5 cortes histológicos de 10 µm del TEP de cada uno de los tres ganglios linfáticos fueron colocados en diferentes microtubos de 1.5 mL.

Método A

Se realizaron dos lavados con xilol y luego dos con etanol. El tejido desparafinado se resuspendió en 300 µl de H₂O destilada estéril y se calentó a 100^oC por 20 min. Se centrifugó a 13 000 rpm por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un microtubo estéril de 1.5 mL limpio. (Método de Lench y colaboradores modificado).⁵

Método B

Los cortes de tejido fueron resuspendidos directamente en 300 µL de una solución de Chelex-100 al 5% y calentados a 100ºC por 30 minutos. Luego se centrifugó a 13 000 rpm por 10 min y se transfirió el sobrenadante a un microtubo estéril de 1.5 mL limpio, sin tomar la resina quelante. (Método de Van den Zarden y colaboradores).⁹

Método C

Se realizaron dos lavados con xilol y luego dos con etanol de forma similar al Método A. Para la digestión del tejido se resuspendieron los cortes en 300 µl de buffer TEN (Tris–HCl, (pH 8.3) 0.04 M, NaCl, (pH 8.0) 0.2 M, EDTA 1 mM) con 5 µl de proteinasa K (Merck, Darmstadt, Germany, 20 mg/ml) y 5.25 µl de SDS 20%. La solución se incubó a 55º C por 4 horas y para inactivar la proteinasa K se calentó a 100º C por 10 min. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación a 13 000 rpm por 10 min, se precipitó con dos volúmenes de etanol absoluto en presencia de NaCl (concentración final 0.2 M). Se incubó la solución a temperatura ambiente por 30 mim, se recentrifugó a 13 000 rpm por 30 min y se resuspendió el precipitado en 40 µl de H₂0 destilada estéril. (Método de Ghossein y colaboradores modificado).¹⁰

La calidad del ADN extraído por los tres métodos se evaluó mediante la amplificación por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) de un fragmento de 245 pares de bases (pb) de la secuencia de inserción 6110 (IS6110) de M. tuberculosis.¹¹ La mezcla de reacción (50 µL) para cada uno de los métodos contuvo Tris/HCl (pH 8.3) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl₂ 1.5 mM, deoxirribonucleótidos (dNTP) 200 µM, iniciador (INS-1 e INS-2) 0.4 mM, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Bioline, Reino Unido), y 5 µL de ADN molde extraído por cada método empleado en el estudio. El perfil de amplificación fue: 96º C por 3 min, 30 ciclos de 1 min a 96º C, 1 min a 65º C y 2 min a 72º C, con una extensión final de 6 min a 72º C. Los productos de la RCP fueron separados en geles de agarosa al 1,2%, visualizados por tinción con bromuro de etidio y luego fotografiados con una cámara digital Power Shot G6 (Cannon, Japón).

En todas las reacciones de RCP como control positivo se empleó ADN extraído del cultivo de una cepa de M. tuberculosis (H37RV) gentilmente entregada por el Laboratorio Nacional de Referencia e Investigaciones de Tuberculosis y Micobacterias, y agua destilada estéril (en lugar de ADN molde) como control negativo.

Para el análisis de los datos se utilizó el paquete estadístico SPSS para Windows (versión 11.5). Fue aplicado el Test de Kruskal-Wallis para la comparación de las medias de las proporciones de las densidades ópticas a 260 y 280 nM (DO₂₆₀/DO₂₈₀).

La integridad del ADN obtenido por cada uno de los métodos se muestra en la figura 1. El ADN genómico extraído por los tres métodos empleados en este estudio está degradado. Sin embargo, el método A es el que presentó mayor deterioro del material genético, este resultado contrasta con el ADN obtenido por el método C con el que se apreció la menor degradación. Por otra parte, el material genómico obtenido por el método B tuvo una degradación intermedia con respecto a los dos métodos antes mencionados.

El promedio de las proporciones de las DO₂₆₀/DO₂₈₀ para los tres métodos empleado fue de 1,33, 1,63 y 1,67 para los métodos A, B y C, respectivamente. Existieron diferencias significativas entre el método A y el resto de los métodos (B y C) (p<0.023). No existieron diferencias significativas (p>0.05) al comparar los métodos B y C.

Para evaluar la calidad del ADN extraído se amplificó la secuencia de inserción (IS 6110) de M. tuberculosis. Se lograron patrones de amplificación sólo cuando se emplearon los métodos B y C. Con el método A no se logró amplificar esta secuencia diana en ninguno de los experimentos realizados (Figura 2).

El método B fue el menos laborioso, al emplear menor cantidad de tiempo (8 min) por parte del investigador para obtener el material genético de los TEP. Por otra parte, el método C es un método bastante laborioso, con múltiples pasos y consume mayor cantidad de tiempo (20 min) cuando es comparado con el resto de los protocolos. El método A es un protocolo intermedio entre el método B y C atendiendo a este criterio, consumiendo 15 min para obtener ADN de los TEP.

figura 1 - <div style= fiogf49gjkf0dFig.1. Patrones electroforéticos obtenidos de la extracción de ADN de los tejidos embebidos en parafina por diferentes métodos:
Línea: 1, 2, 3 (Método A); Línea: 4, 5, 6 (Método B);
Línea: 7, 8, 9 (Método C); Línea: 10 (ADN extraído de cepa de M. tuberculosis (H37RV)).">
figura 1 -

Fig.1. Patrones electroforéticos obtenidos de la extracción de ADN de los tejidos embebidos en parafina por diferentes métodos:
Línea: 1, 2, 3 (Método A); Línea: 4, 5, 6 (Método B);
Línea: 7, 8, 9 (Método C); Línea: 10 (ADN extraído de cepa de M. tuberculosis (H37RV)).

Figura 2 - <div style= fiogf49gjkf0dFig 2. Productos de la reacción en cadena de la polimerasa de los tres métodos de extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina:
Línea 1: control positivo de la reacción; Línea 2, 3, 4 (Método A);
Línea 5, 6, 7 (Método B); Línea 8, 9, 10 (Método C); Línea 11: control negativo de la reacción.">
Figura 2 -

Fig 2. Productos de la reacción en cadena de la polimerasa de los tres métodos de extracción de ADN de tejidos embebidos en parafina:
Línea 1: control positivo de la reacción; Línea 2, 3, 4 (Método A);
Línea 5, 6, 7 (Método B); Línea 8, 9, 10 (Método C); Línea 11: control negativo de la reacción.

Este trabajo constituye el primer reporte de detección molecular de M. tuberculosis en TEP en Cuba.

La extracción de ADN es el primer paso de muchas técnicas moleculares. A pesar de su aparente sencillez, a menudo existen problemas con el rendimiento de los métodos utilizados, la calidad del ADN obtenido, la presencia de posibles contaminantes, degradaciones parciales, así como el tiempo de duración de los protocolos.¹²La situación es más compleja si se refiere a la obtención de ADN de alta calidad a partir de los TEP. Esto se ha convertido en un paso crítico para métodos moleculares.⁸

El deterioro del material genético en este estudio depende directamente del método de ADN empleado. Métodos que emplean la proteinasa K han sido reportados como protocolos eficientes para obtener ADN de alto peso molecular. El método C basa su fundamento en la utilización de este reactivo, el cual rompe el entrecruzamiento entre ácidos nucleicos y proteínas en los TEP y de esa manera libera ADN de mayor talla molecular.⁴ Por otra parte, el calentamiento brusco del tejido (Método A) parece influir sobre el deterioro extremo del ADN obtenido. Sin embargo, el método B al emplear el Chelex-100 impide de cierta manera la degradación mayor del ADN, pues la resina atrapa iones metálicos polivalentes que actúan como catalizadores en la ruptura del ADN a altas temperaturas.¹³

La relación DO₂₆₀/DO₂₈₀ fue calculada para obtener información sobre la pureza del ADN obtenido por cada uno de los métodos utilizados. Los valores de esta relación indicaron que con los métodos B y C (1,63 y 1,67) se obtuvo ADN relativamente puro. No ocurre de la misma manera para el método A donde el bajo valor reportado (1,33) para esta proporción, indicó posibles contaminantes. Existen reportes en la literatura que plantean que la variación en la cantidad y composición del tejido puede influir en la pureza del ADN extraído. Este aspecto no tuvo ningún peso en nuestra investigación, pues se parte de la misma cantidad de tejido para todos los métodos probados (5X10 μm (50 μm)). Además, el tipo de tejido utilizado fue el mismo para los tres protocolos. Otros aspectos, como la preparación de los volúmenes de extracción, empleo de reactivos como la proteinasa K, la duración de la digestión del tejido y la forma de concentrar el ADN, influyen directamente en la pureza del material genético que se obtenga.¹⁴Por esa razón, no son casuales los resultados de este estudio, donde se refleja que el método C presentó la mayor relación de DO y de esta manera, el mayor grado de pureza.

Muchas veces el material genético obtenido no es adecuado para la amplificación por la RCP, debido al fraccionamiento o degradación que sufre el ADN.¹⁵Esto sucede con el método A con el cual no se logró amplificar la secuencia de inserción (IS6110) en ninguno de los experimentos realizados. Similares resultados fueron obtenidos por Stein y colaboradores al emplear este procedimiento para detectar Coxiella burnetti en TEP.¹⁶ Una posible explicación al respecto pudiera ser la ausencia de cantidad detectable de ADN diana debido a la degradación que se produce por el calentamiento del tejido por este protocolo (Método A). En cambio, estos resultados contrastan con los obtenidos por Sepp y colaboradores, los cuales lograron amplificar, por este mismo protocolo, ADN en el 7% de las muestras de cáncer cervical analizadas en su estudio.¹⁵

Cuando fueron empleados los otros dos protocolos siempre se detectó M. tuberculosis en los tejidos analizados. Ambas metodologías han sido empleadas por varios laboratorios para conseguir ese propósito.^6,9,10,17El métodode Chelex - 100 ha sido ampliamente utilizado en la literatura para obtener ADN de los TEP.^11,18,19 En previos estudios, De Armas y colaboradores obtuvieron resultados satisfactorios utilizando esta resina quelante para amplificar fragmentos cortos de secuencias de ADN de M. tuberculosis.¹² Por otra parte, el método C ha sido utilizado para la validación de la RCP para detectar M. tuberculosis en TEP en estudios que involucran a varios laboratorios alemanes los que obtuvieron buenos resultados cuando esta metodología fue empleada.¹⁴

Obtener ADN de los TEP con cantidad y calidad suficiente en el menor tiempo posible es fundamental para el trabajo en Patología molecular. Métodos lentos, costosos y que requieren múltiples pasos pueden hacerse dificultosos para realizarse a gran escala en la práctica clínica.²⁰Esto es uno de los principales inconvenientes del método C, resultando muy laborioso para instaurarlo como rutinario en el laboratorio. Además, emplea entre sus reactivos la proteinasa K, haciéndolo más costoso que el método B. Por otra parte, el método B es rápido, seguro, poco costoso y con él se logró amplificar en todos los experimentos las muestras analizadas. Es válido mencionar que con el método B se obtiene ADN con calidad suficiente en un solo paso, esto evita posibles contaminaciones debido a múltiples pasos (como sucede con el método C).

Estos resultados preliminares demuestran la utilidad del Chelex-100 para extraer ADN de TEP y su posible uso como método rutinario para lograr este propósito en nuestro laboratorio de Anatomía Patológica.

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- JULIO CESAR LESCANO SORIANO (09/05/2007 20:50:04)

DOCTORES DEL INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL DE CUBA

LOS FELICITO ES EXCELENTE ELTRABAJO DE INVESTIGACION DE METODOS DE EXTRACCION DE T.E.P. ES UN AVANZE EN PATOLOGIA MOLECULAR ,ES UN ESTIMULO PARA LOS QUE SE DEDICAN A LA INVESTIGACION MOLECULAR EN PATOLOGIA

- Riánsares Arriazu Navarro (14/05/2007 12:50:10)

Interesante trabajo. Nosotros estamos intentando obtener ADN de TEP y hasta ahora los resulatdos han sido malos. En las próximas semanas vamos a probar con su método B. ¡A ver qué tal nos va!. Muchas gracias por su aportación.

- Mirta Garcia Jardon (30/05/2007 22:21:24)

Mis felicitaciones por tan interesante trabajo!

- JOSÉ ANTONIO CORTÉS TORO (20/06/2007 21:12:02)

Gracias por el interés en mejorar la metodología de "campaña".

- ELIXABETE FUENTES GUTIÉRREZ (30/06/2007 12:11:49)

muy interesante y resaltar la importancia de técnicas de biología molecular en anatomía patológica, saludos

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