USO DE LA NITROCELULOSA EN LAS TINCIONES CITOLÓGICAS, PRESENTACIÓN DE UNA MODIFICACIÓN DE LA TINCIÓN DE SHORR´S DEL PASO ALBA PARA FROTIS LIMPIOS Y DE UN LABORATORIO PORTÁTIL DE CITOLOGÍA.

Dr. Rafael Emmanuel Alba Fernandez^[1]
(1) General de Brigada Médico - Patólogo (Pensionado) Ejército Nacional Ex Jefe del Departamento de Patología del Hospital Central de las Fuerzas Armadas de la República Dominicana REPUBLICA DOMINICANA

Introducción

Materiales y Métodos    

Materiales

B  Pincel del ancho del cubreobjeto. (3/4 de pulgada.).

C  Laca natural con brillo de nitrocelulosa (se usó laca natural con brillo de la fábrica de Pinturas Popular de la República Dominicana)

D  Thinner AAA 2000 (Se usó el thinner AAA 2000 de la fábrica Pinturas Popular de la República Dominicana)

E  Secador de pelo con aire fresco natural.

F  Biebrich Scarlet soluble en agua ( Ponceau BS)

G  Eosina soluble en agua.

H  Ácido Phosphotugstico (A.P.)         

I   Ácido acético glacial.

J  Ligth Green.

K  Orange G.

L  Alcohol de 95%.

Prototipo de un Laboratorio Portátil

 En relación al laboratorio portátil tenemos las siguientes ventajas generales:

· No ocupa espacio.

· No necesita la infraestructura de un laboratorio.

· Puede ser utilizado en la casa o un centro de salud.

· En los programas de detección masiva descentralizaría el trabajo haciendo que estos programas sean más eficientes y más fáciles de administrar.

· Facilita el control de los reactivos ya que con 350 ML de cada uno de los colorantes el citólogo debe reportar 1,000 papanicolaous.

Las ventajas técnicas de este laboratorio son:

 · Facilidad en el trabajo por tener cerca agua.

· Las plaquitas pueden ser sacudidas enérgicamente por la forma en que están sujetadas.

· Si el colorante no cubre completamente las plaquitas, lo que se deja de teñir es la parte esmerilada.  

Preparación de los reactivos

La nitrocelulosa se prepara.

- 60%  de nitrocelulosa.

- 40% de thinner 2000.

El Biebrich Scarlet (B.S.)se prepara para 100 ml.

- Biebrich Scarlet soluble en agua 0.5 gr.

- 100 ml de agua destilada.

- Ácido phosphotungstico 0.5 gr.

- Ácido acético glacial 1 ml.

La eosina se prepara para 100 ml.(Opción 1)

- 100 ml de alcohol de 95% diluido al 50%.

- 0.05 gr. De eosina acuosa.

- 0.05 gr de Bismarck Brown

La eosina se prepara para 100 ml. (Opción 2)

- 100 ml de alcohol de 95% diluido al 50%.

- 0.05 gr. De eosina acuosa.

Tinción  Ligth Green, orange G (L.G – O.G) *.

- 100 ml de alcohol de 95% diluido al 50%.

- Ligth Green 0.1 gr.

- Orange G 0.25 gr.

- Acido phosphotungstico 0.5 gr.

- Acido acético glacial 1 ml.

Paso Alba para frotis limpios

- 100ml de agua destilada

- 2ml de ácido acético glacial

Modo de aplicar la laca

Para aplicar la laca y obtener una capa uniforme  se debe de usar un pincel de buena calidad.

- Se introduce el pincel en la laca, se quita el excedente pasando el pincel por el borde del frasco de la laca.

- Se pone el pincel en uno de los extremos del frotis dejando que la laca se deposite en la plaquita y con el pincel extenderla por toda la superficie.

- Se repite este paso.

Nota:

- La laca no se puede usar con cubre objetos.

- Si en el lugar de trabajo no hay aire acondicionado que controle la humedad, cuando hay mucha humedad en el ambiente la laca no se puede usar porque se torna opaca. En estos casos las plaquitas se deben colocar sobre una superficie con una temperatura de tibia a caliente.

fiogf49gjkf0dFoto N° 1 Tabla multiuso que hace la función de meseta de trabajo">
-

fiogf49gjkf0dFoto N° 2. Teñidor y Parrilla Auxiliar Fabricados en parrillas de organizadores de armarios, son fuertes y revestidos de plásticos para que no se oxiden. En la foto se esquematiza la simplicidad de la Tinción Alba en sus dos versiones. ">
-

fiogf49gjkf0dFoto Nº. 3 Cubito del teñidor, flechas verdes indican topes que impiden el deslizamiento de los cubitos en la parrilla. Fabricado en Brasil por la fábrica Plasútil. Ref. 769 ">
-

fiogf49gjkf0dFoto Nº. 4 El cubito del teñidor tiene capacidad de 440 Ml, cabe una canastilla de 30 plaquitas. Las plaquitas se tiñen en posición vertical con la parte esmerilada hacia arriba y se sujetan con ligas">
-

fiogf49gjkf0dFoto N° 5 Bandeja térmica para ser usada en los días que hay mucha humedad en el ambiente para evitar que laca se torne opaca">
-

Resultados    

En la coloración en donde se uso eosina se consiguió los colores de la tinción de papanicolaou tanto en las células superficiales como en las intermedias (Ver foto Nº. 6). Los colores variaron con el uso y con los ajuste del tiempo de la coloración.

Las células superficiales se tiñeron de un color naranja a rosado y las intermedias de un color verde (5).

En la tinción de Shorr´s modificada el color del citoplasma de las células superficiales se tiñó de un color rojizo pálido y el de las células intermedias y parabasales tomó un tinte verde. Llamó la atención que el núcleo picnótico de las células superficiales se tiñó de rojo así como algunos coilocitos células parabasales y metaplásicas (Ver fotos Nº.7). En el resto, los núcleos se tiñeron normalmente con la hematoxilina (1,5).

Discución    

Nuestro trabajo se realizó modificando la coloración de Shorr´s

Cambios Realizados a la Tinción de SHORR´S

Descripción de Cambios Realizados a la Tinción de SHORR´S

a.  Hematoxilina de Harris para teñir el núcleo.

b.  Se separa el B.S. ó se usa Eosina  (si se quiere la versión papanicolaou).

- Con los reactivos restantes se prepara la tinción  L.G – O.G.

- En un alcohol al 50%

- Se sustituye el Fast Green por el ligth Green para reproducir la tinción de papanicolaou.

- Se elimina el  Ácido phosphomolydrico

En ambas versiones  el tiempo que se debe de dar en los colorantes que tiñen el citoplasma, es un equilibrio entre la eosina o el Biebrich Scarlet con el orange G de la coloración LG – OG. Ese equilibrio nos da la tonalidad deseada de las células superficiales. Asimismo se aumentan o se disminuyen los tiempos para conseguir la tonalidad del verde de las células intermedias.

Aunque la mayoría de los libros describen la coloración de Shorr´s en alcohol de 95% nosotros preferimos la del Manual of Cytotechnology, en la que se utiliza el alcohol al 50% con mejor funcionamiento (1).

Al separar la tinción, la parte compuesta por la coloración LG – Og se preparó en un alcohol al 50%.

La preparación de la coloración ligth Green / Orange G en alcohol de 50% permite niveles altos de hidratación ya que los colores empiezan a definirse con un 10% de concentración de alcohol.

·Es muy simple

·Los reactivos usados preparados en agua y en agua y alcohol son muy estables y fáciles de estandarizar.

1.Tiene una fórmula sencilla y fácil de preparar.

2.No tiene fecha de caducidad ya que los reactivos se preparan cuando se van a usar.

3.Define muy bien los colores (Ver foto No.6).

4.El frotis no se limita al tamaño de un cubreobjeto.

5.Tiene un buen rendimiento, con 350 ml, se tiñeron más de mil (1,000) frotis .

6.Es muy económica ya que no usa alcoholes, xilol, medio de montaje, ni cubreobjetos.

Conclusión    

Bibliografía    

Comentarios

- Claudia Contreras (02/05/2007 20:55:03)

EXCELENTE SU TRABAJO. ME GUSTARIA SABER QUE DIFERENCIA MORFOLOGICA HAY ENTRE EL PAPANICOLAU Y OTROS MICROORGANISMOS COMO LAS TRICOMONAS. SE DETECTAN IGUAL?

- Rafael Emmanuel alba fernandez (03/05/2007 3:19:57)

Dra. Claudia Contreras. de los microorganismos las monilias se tiñen intensamente con el Biebrich Scarlett, las demas se tiñen normalmente pero se ven mejor por la limpieza que tienen los frotis, se usted usa el paso Alba al teñir sus papanicolaous vera la diferencia.
atte. Rafael Alba Fernandez

- Victor Leonel Argueta Sandoval (03/05/2007 5:08:41)

Creo que se ven bien los frotis, según las fotos, si es posible realizar diagnósticos citológicos. Me parece una solución en épocas de crisis. Probablemente se debe pasar por una adaptación .

- Maribel DONASTORG (03/05/2007 21:09:41)

Maribel Donastorg

Una excelente alternativa, Felicidades profesor.

- Nelson Bustamante Sigarroa (05/05/2007 20:17:23)

Creo que su presentacion es excelente, lo destaco ya que efectivamante es aplicable no solamante en su bello pais que he tenido el gusto de estar, sino en otras partes del mundo con caracteristicas similares a las suyas. Muchas gracias y felicidades.

- Lacy Cardoso Brito Junior (10/05/2007 1:24:53)

Prezado Dr. Rafael, parabéns pelo belo trabalho e iniciativa inovadora. Tenho muito interesse em conhecer melhor sua metodologia e compará-la com a de citologia de base líquida. Assim, estou a disposição para novos contatos, parcerias e colaborações. Parabéns mais uma vez. Dr. Lacy (Brasil)

- Reynaldo Álvarez Santana (11/05/2007 6:04:13)

Felicidades Prof Alba, una tecnica que creo debe ser tenida en cuenta.

- MANUEL NICANOR CABALLERO GONZALEZ (14/05/2007 17:24:24)

muy bonito trabajo, creo que puede ser aplicada no nada mas para paises tercer mundistas ya que al no usar alcohol contaminariamos menos nuestro medio ambiente. felicidades.

- ELSIE BEATRIZ PICOTT RANGEL (17/05/2007 15:33:06)

El trabajo es muy interesante y las imágenes citológicas son estupendas.

- Maria Laura Haramboure (19/05/2007 20:47:34)

Muy interesante. Me gustaría saber si es posible conseguir estos reactivos en Argentina y cómo se preparan. Gracias

- Dania Ledesma (23/05/2007 8:52:39)

Excelente presentación.
Felicitaciones.

- JULIO CESAR LESCANO SORIANO (14/06/2007 23:15:06)

EXCELENTE EXPOSICION DR. RAFAEL ALBA FERNANDEZ, FELICITACIONES POR SU CONFERENCIA BIEN INTERESANTE ...PARA EL LABORATORIO DE PATOLOGIA DE HOY!... PREFERENCIALMENTE EN LOS PAISES DONDE LA ECONOMIA,NO ES PERMITIBLE LOS FUERTES COSTOS DE LOS REACTIVOS;UN TRABAJO BIEN METICULOSO DE COMO PREPARAR LOSA REACTIVOS Y COMO SUSTITUIRLOS POR OTROS...MUY BUENAS LAS IMAGENES DE LAS COLORACIONES DE LA CITOLOGIA CERVICAL,Y LAS FORMULAS DE PREPARACION DE LOS REACTIVOS...DR. RAFAEL DESEO EXPRESARLE ALGUNAS INQUIETUDES..POR FAVOR! SOY UN JOVEN PROFESIONAL DE LA PATOLOGIA Y ME GUSTO LA CONFERENCIA Y MIS PREGUNTAS SON....
1. PORQUE...EN EL MUNDO DE HOY SE COMENZO,A VER LA MODIFICACION DE LA TINCION DE PAP, SE SUS VENTAJAS DE SU PROPUESTAS POR FAVOR CON TODO RESPETO ME REFIERO...O ES QUE EL LA TINCION DE PAP,DE YA MAS DE 60 AÑOS NO TIENE VIGENCIA....O NO SE ESTARIA USANDO ?.....
2 .UN FUNDAMENTO DEL USO DE LA NITROCELULOSA,ES LA RESISTENCIA ALOS CAMBIOS DE CLIMA,FIJA,NO CAMBIA LOS COLORES,EN LA TINCION,ETC, PERO HAY OTROS FUNDAMENTOS..EL PORQUE ESTE ELEMENTO....PUEDE EXISTIR OTRO COMPUESTO..QUIMICO...?....
3.TODO ESTA TINCION MODIFICADA SE TIENE QUE HACER PRUEBAS DE ENTRENAMIENTO EN LOS LABORATORIOS DE PATOLOGIA, PARA IMPLANTARLOS A LOS HOSPITALES,CENTROS DE SALUD,INSTITUTOS ONCOLOGICOS,ETC,
4. EXISTE LA TINCION DE PAP, CONVENCIONAL CREADA DESDE HACE 60 AÑOS, DISCULPE LA PREGUNTA LO QUE PASA DESEO ACLARAR LOS CONCEPTOS,POR FAVOR....PERO LA VERSION PAP, POR TINCION PAP,?QUE ES? Y LA VERSION SHORR'S,
QUE ES?....
5. EL PASO ALBA ES REALIZAR EL FROTIS LIMPIO,SUMERGIENDO LA LAMINA CON LA FORMULA DE AGUA DESTILADA MEZCLADA DE AC,ACETICO GLACIAL..?..O ES TODO EL PROCESO DE LA TINCION MODIFICADA DE PAP EN SU PROPUESTA..?...
6. SERA MUY PELIGROSO USAR LA NITROCELULOSA EN UN LABORATORIO DE PATOLOGIA,..?....DISCULPE USTED DR. RAFAEL ALBA,PERO DESEO APRENDER MAS Y SOY UN PROFESIONAL DE LA PATOLOGIA QUE ME IDENTIFICO MUCHISIMO! MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION Y LINDA CONFERENCIA....GRACIAS!...

- Rafael Emmanuel alba fernandez (21/06/2007 2:19:53)

Estimado Dr.JULIO CESAR LESCANO SORIANO
En relación a sus inquietudes le diré que la tinción de papanicolaou es la más difundida mundialmente para los estudios citologicos. La tinción de Shorr´s se usó en la decada del 40 del siglo pasado y su finalidad era la de hacer estudios citohormonales ya que como fue consevida no tenía utilidad práctica en los estudios citlogicos.
En relación al uso del acido acetico al inicio de la tincion he llegado a la siguiente conclusión:
En la coloracion de papanicolaou tradicional las sustancias que limpia los frotis es el xilol la cual esta en la parte final de la tincion por lo que los frotis son teñidos sucios lo que evita que los colorantes actuen adecuadamente. Al limpiar las plaquitas con acido acetico aumenta conciderablemente la eficiencia de los colorantes.
En relacion a la nitrocelulosa esta no ofrece ningun peligro en su manejo ya que la laca de la nitrocelulosa es una pintura que se usa universalmente en todas partes.
Si tiene algun otra inquietud me puede escribir a mi correo:
rafaelalbaf@yahoo.com

Atentamente.
Dr. Rafael Alba