Direccion de contacto Adriana Elias, Cátedra de Bioestadística, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán.
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PASAJE DE LA SACARINA DE SODIO A TRAVES DE LA BARRERA HEMATOENCEFALICA EN EL SNC DE RATONES DE LA CEPA BALB C- PRUEBAS EXPERIMENTALES
Susi Davolio[1], Adriana del Carmen Elias[2], Hugo H. Vitalone[1], Georgina N. Torres Nieto de Mercau[1], Norma Sosa[1], Guillermo Mercau[1], Sergio Orlando Gomez[1], Diego Abdala[1]
(1) Cátedra de Histología. Departamento Biomédico. Facultad de Medicina. Universidad Nacional de Tucumán. ARGENTINA (2) Cátedra de Bioestadística, Facultad de Bioquímica, Quìmica y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán ARGENTINA
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Resumen
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Dado que la sacarina de sodio es consumida en forma indiscriminada por la población y que no se ha determinado aún su inocuidad (aspectos no cancerígenos) en relación a su efecto en el embrión y durante la gestación, como así tampoco sobre las células espermáticas y en el cerebro, es que se diseño e implemento este estudio a partir de la inoculación de Sacarina marcada con Carbono 14 en ratones de la cepa Balb C.
OBJETIVO: Comprobar si la sacarina de sodio atraviesa la barrera hematoencefálica, del SNC del ratón.
MATERIALES Y METODOS: Se utilizaron 5 ratones adultos, de tres meses de vida, de la cepa Balb C, endocriados, provenientes de dos madres de una misma camada y un mismo padre. Todos los animales machos y sus pesos corporales oscilan entre 39,00 a 47,00 gramos, mantenidos a 21ºC y 50% de humedad, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales, fueron alimentados con una misma dieta y agua corriente ad-libitum. Los ratones fueron separados en dos grupos: un primer grupo (G1) constituido por tres ratones y un segundo grupo (G2) por dos ratones. Ambos grupos fueron inyectados por la vena de la cola, con 0,1 ml de sacarina de sodio marcada con Carbono14 (1milicuries por ratón) (CBN-California Bionuclear Corporation, Los Angeles, USA, lote 2065). El grupo G1 se procesó pasados los 5 minutos de la inoculación y el grupo G2 a las 24 horas, siguiendo un protocolo de trabajo. Para el estudio se analizaron radioautografias; y para verificar la homogeneidad de los pesos de las unidades experimentales -bajo estudio- se utilizó un estudio exploratorio descriptivo .
RESULTADOS: Las placas radioautográficas revelaron presencia de sacarina de sodio marcada en la corteza cerebral del ratón, alternando sectores de alta y baja concentración, no se observaron diferencias significativas en los pesos.
CONCLUSIONES: a partir de las autoradiografias podemos inferir que la sacarina de sodio es incorporada por las células de la corteza cerebral, que atraviesa la barrera hematoencefálica del ratón con posibles efectos en las funciones fisiológicas neuronales.
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Introduccion
La existencia de sistemas de transporte bidireccional en el endotelio de los capilares cerebrales para K+, ácidos orgánicos, aminoácidos y glucosa se demostró hace muchos años. El agua, el CO2, el O2, materiales liposolubles pequeños y ciertos fármacos, cruzan fácilmente la barrera hematoencefálica. La glucosa, aminoácidos, algunas vitaminas y nucleósidos, se transfieren por proteínas portadoras específicas mediante difusión facilitada. Los iones se transportan por canales iónicos por transporte activo (1, 2).
En general, la rapidez con la cual penetran las sustancias en el tejido encefálico está inversamente relacionada con el tamaño molecular y directamente con la solubilidad en los lípidos, mientras que los compuestos polares hidrosolubles generalmente cruzan lentamente.
La barrera hematoencefálica es la encargada de mantener constante el ambiente de las neuronas en el SNC. Estas neuronas son también dependientes de la concentración de K+, Ca2+, Mg2+, H+ y otros iones en el líquido extracelular de modo que cualquier variación por pequeña que sea, puede tener consecuencias importantes. Otras funciones de la barrera son la protección del cerebro contra toxinas, tanto endógenas como exógenas, que llegan por la sangre. Actualmente el listado de compuestos que pueden cruzar dicha barrera se ha amplificado, incorporando al mismo sustancias que se consideraban inocuas entre las que se debe incluir a la sacarina de sodio.
La sacarina (2,3- dihidro-3-oxobenzisosulfonazole) fue el primer edulcorante acalórico, descubierta por el joven químico alemán Constantin Fahlberg en 1879 a partir de la purificación del metilantralinato, presente en las uvas. Siendo su poder endulzante de 300 veces más que el azúcar.
En 1959, EEUU la incluyó en la primera lista de aditivos GRAS (generalmente reconocidos como seguros). Sin embargo en los años 70, varios grupos de investigadores argumentaron, tras varios estudios, que dosis altas de este edulcorante consumidas diariamente eran capaces de inducir la aparición de cáncer de vejiga de ratas (dosis equivalentes a las que contienen 250 latas de refresco). Así en 1972 la sacarina fue eliminada de la lista de aditivos GRAS y en 1981, pasó a integrar el listado de las 169 sustancias cancerígenas, entre las que se encuentran el cloroformo y el benceno.
En 1999, las autoridades estadounidenses decidieron eliminar la sacarina de la nueva lista de sustancias cancerígenas y actualmente sigue estando autorizado su consumo, pero con la reglamentación de indicar en las etiquetas de los productos la cantidad que presentan. Esto, luego de determinar que la Ingesta Diaria Admitida (IDA) para la sacarina es de 2,5 a 5,0 mg por kilo de peso al día para las personas normales (lo que se traduce en 175 mg para la persona adulta de 70 Kg) y de 5,0 a 15,0 mg por kilo de peso al día para los diabéticos adultos. Considerándose que en esta dosis, dicho edulcorante no presentaría riesgos para la salud humana (5).
Nuestra hipótesis se basa en la suposición que la sacarina de sodio ejercería alguna influencia a nivel del SNC, por lo que el presente trabajo se orienta a determinar si existe dicha relación y su probable mecanismo.
OBJETIVO: Comprobar si la sacarina de sodio atraviesa la barrera hematoencefálica, del SNC del ratón.
JUSTIFICACIÓN: Dado que la sacarina de sodio es consumida en forma masiva por la población y no se ha determinado aún su inocuidad (aspectos no cancerígenos) en relación a su efecto en el embrión y durante la gestación, como así tampoco sobre las células espermáticas y cerebro, es que iniciamos este estudio para volcar los resultados a la comunidad como prevención para la salud pública. Muchas patologías diagnosticadas como de origen inespecífico, tanto en niños como en adultos, podrían deberse al consumo de este edulcorante (7).
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Material y Métodos
Animales: Se utilizaron 5 ratones adultos, de tres meses de vida, de la cepa Balb C, endocriados, provenientes de dos madres de una misma camada y un mismo padre. Todos los animales machos y sus pesos corporales oscilan entre 39,00 a 47,00 gramos, mantenidos a 21ºC y 50% de humedad, con 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Los animales, fueron alimentados con una misma dieta y agua corriente ad-libitum.
Tratamiento: Los mismos fueron separados en dos grupos: un primer grupo (G1) constituido por tres ratones y un segundo grupo (G2) por dos ratones.
Ambos grupos fueron inyectados por la vena de la cola, con 0,1 ml de sacarina de sodio marcada con Carbono14 (1milicuries por ratón) (CBN-California Bionuclear Corporation, Los Angeles, USA, lote 2065).
El grupo G1 se procesó pasados los 5 minutos de la inoculación y el grupo G2 a las 24 horas, de la siguiente manera:
1- los ratones fueron anestesiados con Nembutal (50mg/kg de peso)
2- luego fueron perfundidos por vía cardíaca en ventrículo izquierdo, con 30 ml de solución fisiológica con heparina, para extraer toda la sangre.
3-se continuó con 30 ml de formol bufferado según Backer.
4- se disecaron las cabezas de los ratones y se extrajo los encéfalos de la caja craneana.
5- las piezas encefálicas se colocaron y mantuvieron en formol bufferado s/Backer frío, para completar su fijación y conservarlos hasta el momento de procesar el material.
6- los cortes se realizaron con micrótomo de congelación. Los mismos fueron obtenidos de la corteza cerebral temporal a 30 micras (mm), recogidos sobre portaobjetos albuminizados y deshidratados en estufa a 30ºC durante 3 a 4 días.
7- a continuación se colocó sobre los cortes la placa radioautográfica (6) y todo el conjunto dentro de una cámara oscura, donde permanecieron durante diez días de exposición.
8- las placas fueron reveladas y los cortes teñidos con hematoxilina- eosina
9- se obtuvieron las fotografías de las placas montadas sobre los preparados en los portaobjetos y ya teñidos
10- se utilizó un estudio estadístico: descriptivo exploratorio.
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Resultados
El peso promedio del grupo G1 fue de aproximadamente 43,0 gramos y del grupo G2 de 46,0 gramos (Gráfico 1). Los grupos no difieren en los pesos promedios - grupos homogeneos en medias-, por lo tanto se acepta que es correcto inyectar la misma dosis a todas la unidades experimentales bajo estudio.
Las placas radioautográficas (R1- R4) revelaron la presencia de la sacarina de sodio marcada en la corteza cerebral del encéfalo del ratón. La precipitación de la plata provocada por la emisión del C14 incorporado a la molécula de sacarina en la placa radioautográfica, es indicativa de su presencia y distribución gracias a la gran irrigación que presenta este órgano.
La distribución de la sacarina de sodio en la corteza cerebral se presentó heterogénea, alternando sectores de alta concentración con sectores de baja concentración. La precipitación de la plata finamente granulada de las placas radioautográficas delinea citoplasmas neuronales y sus prolongaciones, como así también a las células gliales. En las placas radioautográficas se observa que algunas neuronas tienen el citoplasma y sus prolongaciones más oscuras que otras, lo que indica diferencias en la concentración de sacarina de sodio en los citoplasmas y prolongaciones neuronales. En el presente trabajo demostramos que la sacarina de sodio al ser inyectada en la vena de la cola del ratón, llega al SNC del ratón por medio de los vasos sanguíneos, utilizando como medio de distribución periférico el espacio subaracnoideo desde donde ingresan una red de capilares a la masa encefálica, salvando así la barrera o glia limitans que rodea periféricamente al SNC. Ya en el interior de la corteza cerebral atraviesa la barrera hematoencefálica constituida por los capilares continuos y envainados por los astrocitos, incorporándose tanto a las neuronas como a las células gliales de la corteza.
fiogf49gjkf0dEl peso promedio del grupo G1 fue de aproximadamente 43 g y del grupo G2 de 46 g., presentando mayor variabilidad [SEM]. Como resultado de un test "t" no se encontraron diferencias significativas en medias (p<0,05) y al calcular la tasa de variación relativa entre las Medianas (TVRMe) podemos observar que G1 presenta un peso promedio mediano de aproximadamente un 7% mayor que G2- valor no significativo. Conclusión: Los grupos son homogeneos en medias y medianas.">
GRAFICO 1 - fiogf49gjkf0d El peso promedio del grupo G1 fue de aproximadamente 43 g y del grupo G2 de 46 g., presentando mayor variabilidad [SEM]. Como resultado de un test "t" no se encontraron diferencias significativas en medias (p<0,05) y al calcular la tasa de variación relativa entre las Medianas (TVRMe) podemos observar que G1 presenta un peso promedio mediano de aproximadamente un 7% mayor que G2- valor no significativo. Conclusión: Los grupos son homogeneos en medias y medianas.
fiogf49gjkf0dCorteza cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. El precipitado de plata de la placa radioautográfica muestra un delineado por los bordes de la corteza temporal, indicando la presencia de la sacarina de sodio en esos sitios donde circula una vasta capilarización que luego ingresa a la masa encefálica Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 20x.">
RADIOAUTOGRAFIA 1 - fiogf49gjkf0d Corteza cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. El precipitado de plata de la placa radioautográfica muestra un delineado por los bordes de la corteza temporal, indicando la presencia de la sacarina de sodio en esos sitios donde circula una vasta capilarización que luego ingresa a la masa encefálica Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 20x.
fiogf49gjkf0dCorteza cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. El precipitado de plata de la placa radioautográfica señala la distribución de la sacarina de sodio tanto en la periferia de la corteza como en el interior de la masa cerebral. Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 20x.">
RADIOAUTOGRAFIA 2 - fiogf49gjkf0d Corteza cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. El precipitado de plata de la placa radioautográfica señala la distribución de la sacarina de sodio tanto en la periferia de la corteza como en el interior de la masa cerebral. Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 20x.
fiogf49gjkf0dCorteza Cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. Se observan los cuerpos neuronales y sus prolongaciones de color oscuro, lo que indica que la sacarina de sodio es incorporada por las neuronas y células gliales. Algunos grupos neuronales se observan más oscuros lo que demuestra que incorporaron más cantidad de la sacarina de sodio que las otras neuronas. Las prolongaciones se delinean y observan tanto en el perfil longitudinal como en el transversal. Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 40x: a- cuerpo neuronal, b- prolongación, c- célula glial, d- prolongación neuronal en corte longitudinal.">
RADIOAUTOGRAFIA 3 - fiogf49gjkf0d Corteza Cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. Se observan los cuerpos neuronales y sus prolongaciones de color oscuro, lo que indica que la sacarina de sodio es incorporada por las neuronas y células gliales. Algunos grupos neuronales se observan más oscuros lo que demuestra que incorporaron más cantidad de la sacarina de sodio que las otras neuronas. Las prolongaciones se delinean y observan tanto en el perfil longitudinal como en el transversal. Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 40x: a- cuerpo neuronal, b- prolongación, c- célula glial, d- prolongación neuronal en corte longitudinal.
fiogf49gjkf0dCorteza Cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 40x: a- cuerpo neuronal, d- prolongación neuronal, e- prolongación neuronal en corte longitudinal, f- neuronas que muestran una intensa concentración de sacarina de sodio marcada, g- grupos de neuronas y células gliales con alta concentración de sacarina de sodio marcada.">
RADIOAUTOGRAFIA 4 - fiogf49gjkf0d Corteza Cerebral temporal del ratón al cual se le incorporó in vivo la sacarina con C14. Toma fotográfica de placa radiográfica coloreada con H-E, 40x: a- cuerpo neuronal, d- prolongación neuronal, e- prolongación neuronal en corte longitudinal, f- neuronas que muestran una intensa concentración de sacarina de sodio marcada, g- grupos de neuronas y células gliales con alta concentración de sacarina de sodio marcada.
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Discusión
A partir de las radioautografías podemos inferir que la sacarina de sodio es incorporada por las células de la corteza cerebral y atraviesa los capilares corticales envainados por las membranas de los pedicelos de los astrocitos. Las posibles explicaciones de este fenómeno podrían ser:
* el bajo peso molecular de la sacarina de sodio, con una estructura espacial cíclica compacta lo que le permitiría atravesar a las células endoteliales, la membrana basal capilar y la membrana de los astrocitos,
*su carga neta electronegativa que facilitaría su pasaje.
El paso de la sacarina de sodio al atravesar la barrera hematoencefálica del encéfalo del ratón, podría ser motivo de disfunciones fisiológicas neuronales afectando posiblemente la memoria y/o comportamiento. Se ha demostrado que la sacarina de sodio se une a los receptores opiáceos y que la ingesta continua de la misma es acompañada por un decrecimiento a la unión de receptores opiáceos de modo que interfiere con la analgesia de la morfina o sea disminuye la analgesia que produce la morfina.
También se ha observado que el consumo oral crónico de este edulcorante produce un incremento emocional en ratas de la cepa LoS. En reiteradas experiencias realizadas en nuestro laboratorio, con ratones a los que se les suministró sacarina de sodio, en forma crónica, pudimos observar que los mismos presentaban hiperexitabilidad e hiperquinesia, características similares a lo informado por otros autores (2,3,4) y observadas por nosotros en un estudio conductual realizado con posterioridad, sobre ratones cuyas bebidas estuvieron adicionadas con 3 gr/l de sacarina durante 6 meses.
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Conclusiones
Por todo lo expuesto, pensamos que la ingesta crónica de este producto por parte del ser humano, podría desarrollar estados de excitabilidad, ansiedad y falta de memoria. Esto implica que si bien la sacarina no es una sustancia letal tampoco se la puede considerar como inofensiva, ya que introducida en el organismo provoca alteraciones morfológicas y funcionales a nivel de diferentes órganos, por lo que su consumo indiscriminado atenta con la calidad de vida del individuo.
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Agradecimientos
Agradecemos PM la participación del Dr. Hugo H. Vitalone, quien falleció durante la realización del presente trabajo.
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Bibliografía
1- Ganong William F; Fisiología Médica, 17ª Ed, 2000, Editorial El Manual Moderno, México, D.F.,México.
2- Gartner Leslie P., Hiatt James L.; Texto- Atlas de Histología, 2a Ed, 2001, Editorial McGraw- Hill Interamericana.
3- Blanchard RJ, Kaawaloa JN, Hebert MA, Blanchard DC, Cocaine produces panic- like flight responses in mice in the mouse defense test battery. Pharmacology Biochemistry and Behavior 1999, 64,3: 523- 528.
4- Holmes A, Parmigiani S, Ferrari PF, Palanza P, Rodgers RJ; Behavioral profile of wild mice in the elevated plus- maze test for anxiety. Physiology & Behavior 2000; 71: 509- 516.
5- Belzung C, El Hage W, Moindrot N, Griebel G, Behavioral and neurochemical changes following predatory stress in mice. Neuropharmacology 2001; 41: 400- 408.
6- Torresani ME, Somoza MI, Lineamientos para el cuidado nutricional, Editorial Eudeba 2005: 605.
7- Freifelder D, Autorradiografía, “Serie de Biología Fundamental”-Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular, 6: 132-156, Editorial Reverté, S.A.
8- Gianuzzi Leda, Aspectos toxicológicos y tecnológicos de aditivos en alimentos,2006, Nota Opinión, Ministerio de Salud de la Provincia de Buenos Aires, Argentina
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Comentarios
- Mayder Martínez López (25/05/2007 3:23:20)
Quiero felicitar a los autores del trabajo , pues está muy interesante
- Zurama Eloisa Castro Castro (26/12/2007 14:14:23)
EL ESTUDIO DE LOS FARMACOS QUE SON CAPACES DE ATRAVESAR LA BARRERA HEMATOENCEFALICA COBRA CADA VEZ MAS IMPORTANCIA, ES UN ACERCAMIENTO VALIDO EL PRESENTE TRABAJO POR LO QUE SE RECOMIENDA CONTINUEN POR ESA VIA,
FELICITACIONES,
ZURAMA.
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