Nº 784. Comunicación libre
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IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS MADRE TUMORALES EN LÍNEAS CELULARES DE GLIOBLASTOMA Jana Balbuena[1], Mónica Enguita[1], Paula Schiapparelli[1], Paula Lázcoz[2], Javier S. Castresana[1] |
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lay:none">fiogf49gjkf0dINTRODUCCIÓN: La hipótesis de la existencia de células madre tumorales (células SP, side population) tanto en tumores sólidos de glioblastoma como en líneas celulares está sometida a estudio en la actualidad. Se piensa que estas células son las únicas con capacidad de formar el tumor, mantenerlo y proporcionar la resistencia a los fármacos habituales. El origen de la población SP se desconoce, pero se cree que puede surgir de transformaciones de las células madre neuronales normales, ya que ambos tipos celulares poseen ciertas características similares, como expresión de genes relacionados con la inmadurez celular, capacidad de autorrenovación, y diferenciación hacia distintos tipos celulares como astrocitos o neuronas. Esta población puede detectarse por diversos métodos, como estudio de genes asociados a células madre o con la técnica del Hoechst 33342 (fluorocromo que se expulsa de la población SP gracias a la existencia de unos transportadores específicos). OBJETIVOS: Identificación de la población SP en líneas celulares de glioblastoma para proceder a su separación y posterior caracterización celular y genética. MATERIAL Y MÉTODOS: El estudio se realizó sobre 10 líneas celulares de glioblastoma: A172, GOS3, T98G, LN405, SW1088, SW1783, CCF-STTG1, MOG-G-CCM, U-87MG y U118. Para identificar las células madre tumorales, se estudió la expresión de marcadores asociados con inmadurez celular, como c-Kit, Vimentina, bmi-1, CD44 y Melk mediante RT-PCR semicuantitativa y posterior estudio de metilación de sus promotores y el estudio de la capacidad de esa población de eluir de su interior el colorante específico de células madre Hoechst 33342 cuando las células son incubadas con o sin presencia de verapamil (fármaco que inhibe a los transportadores específicos). RESULTADOS: Todas las líneas mostraron expresión de los genes analizados salvo U87-MG que fue negativa para c-Kit. Ninguna línea estaba metilada para los genes vimentina y CD44 pero para c-Kit había líneas metiladas en distinto grado y no metiladas. La técnica del Hoechst 33342 reveló la presencia de una población con baja fluorescencia, que desaparecía en distinto grado cuando era incubada con verapamil. CONCLUSIONES: El gen c-Kit no está regulado por metilación en las líneas estudiadas. Los resultados obtenidos con el marcaje con Hoechst sugieren que hay una pequeña proporción de células de baja fluorescencia, las cuales podrían ser la población SP, y se confirma con la expresión mediante RT-PCR de genes asociados a inmadurez celular. La diferencia de fluorescencia emitida por el Hoeschst podría ser una buena técnica para aislar las células madre tumorales del resto de células tumorales que forman el tumor, mediante FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter).
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El glioblastoma multiforme es un tumor del sistema nervioso central y se corresponde con el grado IV de malignidad celular declarado por la OMS. Estudios recientes han demostrado que el glioblastoma es un tumor que presenta una pequeña proporción de células madre tumorales (denominadas side population, células SP), que serían las únicas responsables de la formación y mantenimiento del tumor, así como de la resistencia a los tratamientos convencionales. Estas hipótesis han sido demostradas tanto en tumores primarios de glioblastoma, como en líneas celulares (1, 2, 8). Este tipo de células tiene muchas características similares con las células madre neuronales, incluyendo la expresión de marcadores celulares superficiales e intracelulares, activación de vías de señalización, autorrenovación, formación de neurosferas in vitro y la formación de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Debido a ello se cree que los tumores cerebrales podrían originarse a partir de la transformación de las células madre neuronales o de un progenitor más restrictivo (3,4). Las células madre tumorales expresan unos marcadores específicos, entre ellos c-KIT, Melk, Vimentina, CD44 y Bmi-1. Bmi-1 es un factor de transcripción polycomb, que puede regular la autorrenovación, tanto en células madre normales como tumorales, es decir, en progenitores del sistema nervioso central y periférico, en parte por represión de genes (como p19Arf y p16ink4a) que promueven la senescencia y muerte celular. Recientemente se ha visto que es una diana de la vía de señalización Shh (Sonic hedgehog) en progenitores neurales en el cerebelo. Así, una elevada expresión de bmi-1 en tumores cerebrales pueden reflejar un aumento de la capacidad de autorenovación (5). La vimentina es una proteína de la familia de las proteínas de los filamentos intermedios y está implicada en el mantenimiento de la posición de los diferentes orgánulos en el citoplasma. Asimismo está implicada en el transporte intracelular de proteínas desde el núcleo hasta la membrana plasmática y se expresa durante estadios tempranos del desarrollo en distintos tipos celulares entre los que se encuentran los astrocitos. c-KIT/CD117 es un protooncogén que codifica una proteína tirosín-kinasa de tipo III receptora de transmembrana, perteneciente a la familia que incluye a los receptores PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas). Su ligando es el stem cell factor, expresado por células con características de pluripotencialidad (6). MELK (Maternal embryonic leucine-zipper kinase) codifica una serín/treonina kinasa con un dominio leucine-zipper y es un miembro poco caracterizado de la familia snf1/AMPK. Varios miembros de esta familia se conocen como factores de supervivencia tumoral bajo condiciones con pocos nutrientes. Las células madre neuronales normales y tumorales tienen una elevada expresión de MELK. Se ha visto que MELK está altamente correlacionado con la malignidad de una variedad de tumores y que es un importante regulador de la progresión del ciclo celular en estas células tumorales, aunque su mecanismo es desconocido (5). CD44/H-CAM, glicoproteína transmembrana perteneciente a los receptores de la superfamilia de inmunoglobulinas, es el principal receptor del ácido hialurónico. Está implicado en procesos de interacción células-matriz, migración celular, regulación del crecimiento tumoral y metástasis y se cree que puede estar involucrado en la invasión celular en gliomas (7). La población SP también pueden ser detectada por la habilidad de las células stem de expulsar de su interior el fluorocromo Hoechst 33342, colorante permeable a la membrana plasmática que se utiliza para determinar el contenido de ADN de las células vivas. Es un colorante específico de ADN y tiene una unión preferente por las bases A-T. Las células madre tumorales presentan expresión elevada de unos transportadores específicos que protegen a las células de agentes citotóxicos (transportadores ABC: ATP-binding cassette) como el ABCG2/BCRP1 (breast cancer-resistant protein 1), o el MDR (multidrug-resistant gene 1). Gracias a ello, al usar el fluorocromo Hoechst 33342 se identificaría una población SP de baja fluorescencia, enriquecida en células madre (8, 9). En base a la expresión de estos transportadores y su habilidad para eluir dicho fluorocromo se han aislado células madre hematopoyéticas, por ejemplo. Para confirmar que la población de baja fluorescencia se corresponde con las células madre tumorales, las líneas se incuban con verapamil, inhibidor de algunos transportadores ABC sensibles a verapamil, por lo que la población SP desaparece en presencia de verapamil (10).
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Material: Las líneas celulares de glioblastoma multiforme a estudiar son: A172, GOS3, T98G, LN405, SW1088, SW1783, CCF-STTG1, MOG-G-CCM, U-87MG y U118. Todas ellas son células adherentes y crecen en medio de cultivo RPMI + glutamax suplementado con un 10% de SFB (suero fetal bovino), 1% de Penicilina/Streptomicina y un 0,1% de Anfotericina B. Métodos: La identificación de células madre tumorales se llevó a cabo por 2 métodos: a) el estudio de la expresión mediante RT-PCR de diversos genes asociados a células madre con su posterior estudio de metilación de los promotores y b) el análisis mediante FACSAria de la capacidad de las células SP de bombear el fluorocromo Hoechst 33342. Extracción de RNA y Retrotranscripción: Se realizó una extracción de RNA de los pellets de las líneas con el QuickPrep Total RNA Extraction Kit (Amersham Biosciences). El RNA se retrotranscribió a cDNA mediante el kit SuperScript retrotranscriptase (Invitrogen Life Technologies). RT-PCR: Los cebadores específicos (Tabla 1) se diseñaron con el programa Beacon Designer 5.0. Las condiciones de los procesos de la RT-PCR pueden consultarse en la Tabla 2. Estudio de metilación: Tratamiento con bisulfito sódico: En primer lugar se trató el DNA con bisulfito sódico, reactivo que transforma las citosinas no metiladas en uracilos, mientras que la metilación protege a las citosinas metiladas de pares CpG que no son modificadas a uracilos en presencia del bisulfito. Para ello se utilizó el kit “CpGenome DNA Modification Kit” de Chemicon. Real Time PCR: Para diferenciar las secuencias no metiladas de las metiladas nos basamos en la diferencia que va a existir en su temperatura de melting. Esto se debe a que al ser modificadas las citosinas no metiladas, las parejas C:G pasan a ser parejas A:T. Al variar la proporción de pares C:G se modifica la temperatura de melting del fragmento amplificado, disminuyendo conforme aumenta la proporción de pares A:T. Se estudió la metilación para los genes CD44, c-KIT y vimentina. Los cebadores empleados y las condiciones de PCR utilizadas pueden consultarse en las Tablas 3 y 4 respectivamente. Marcaje con Hoechst 33342: Un millón de células fueron marcadas con el fluorocromo Hoechst 33342 a una concentración final de 2,5 µg/ml durante hora y media a 37º con y sin verapamil a una concentración final de 50 µM. Antes del análisis se incubaron con ioduro de propidio a una concentración de 2 µg/ml para discriminar del análisis las células muertas. El Hoechst 33342 es excitado a una longitud de onda de 350 nm y su emisión la detectamos con 2 longitudes de onda diferentes (mínima y máxima: Hoechst blue: 450/40 nm y Hoechst red: 575/26 nm). Posteriormente las células se analizaron mediante FACSAria (Fluorescente Activated Cell Sorter).
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Todas las líneas mostraron expresión positiva para los genes analizados salvo para el gen c-Kit, donde U87MG fue negativa y MOG-G-CCM mostró muy bajo nivel de expresión (Figura 1). Ninguna línea estaba metilada para el gen Vimentina y CD44. La única línea no metilada para el gen c- Kit fue U87MG y el resto de líneas estaban metiladas aunque en distinto porcentaje. Claramente metiladas estaban las líneas A172 y GOS 3 y CCF-STTG1. Para el resto de líneas existe metilación pero parcialmente (Figura 2). Todas las líneas analizadas con Hoeschst 33342 mostraron una población SP de baja fluorescencia en distinta proporción y se vio que prácticamente en todas las líneas esa población disminuía en mayor o menor grado (salvo para LN405, donde la proporción aumentó escasamente) cuando eran incubadas simultáneamente con el fármaco verapamil, que inhibe los transportadores específicos (Figura 3). A continuación se muestra una tabla con los distintos porcentajes obtenidos de la población SP cuando son incubadas con Hoechst 33342 y simultáneamente con verapamil (Tabla 5).
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Con los datos obtenidos mediante la técnica del Hoechst 33342, aplicada sobre líneas celulares de glioblastoma, podemos decir que hay una población de células de baja fluorescencia que desaparece en presencia de verapamil, gracias a los transportadores específicos ABCG2/BCRP1 o MDR. Estos transportadores confieren resistencia a quimioterapia en varios tipos de tumores, y son expresados en muchos tipos de células madre. Por ejemplo, el transportador BCRP1 elimina de su interior el fluorocromo Hoechst 33342, identificando una población SP sin marcar, la cuál estaría enriquecida en células madre. Ésta puede ser una de las causas de por qué la quimioterapia o radioterapia no consigue buenos resultados, ya que una pequeña proporción de estas células que hayan conseguido sobrevivir serían capaces de volver a formar el tumor y mantenerlo (10). Estos transportadores constituyen una buena diana para intentar combatir los tumores, consiguiendo que los tratamientos quimioterápicos fueran más eficaces, ya que no serían eliminados por estos tipos celulares. La visualización de una subpoblación SP en el marcaje con Hoechst se correlaciona con la expresión de los genes de inmadurez celular anteriormente descritos, por lo que quedaría confirmada la existencia de una pequeña proporción de células con posibles características de células inmaduras o células stem tumorales. La técnica del Hoechst 33342 podría ser una buena técnica para aislar las distintas subpoblaciones dentro de una misma línea celular (células madre tumorales versus células tumorales) y así intentar determinar si existen diferencias entre unas y otras, así como si las células madre tumorales originan las células tumorales. También pueden compararse las células madre tumorales con las células madre neuronales normales. Con los resultados obtenidos sobre metilación, en los que hemos detectado expresión de c-Kit asociada a metilación total o parcial de su promotor, podemos concluir que la metilación no está silenciando al gen.
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Agradecemos la ayuda técnica prestada por parte de Izaskun Gabari, con el equipo FACSAria (BD Bioscience), de la Unidad de Citometría, Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona.
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1.Sheila K. Singh, Ian D. Clarke, Mizuhiko Teraski, Victoria E. Bonn, Cynthia Hawkins, Jeremy Squire, and Peter B. Dirks. 2003. Identification of a Cancer Stem Cell in Human Brain Tumors. Cancer Research 63, 5821-5828. 2. Rossella Galli, Elena Blinda, Ugo Orfanelli, Barbara Cipelletti, Angela Gritti, Simona De Vitis, Roberta Fiocco, Chiara Foroni, Francesco Dimeco, and Ângelo Vescovi. 2004. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research 64, 7011-7021. 3. Trudy G. Oliver and Robert J. Wechsler-Reya. 2004. Getting at the Root and Stem of Brain Tumors. Neuron, Vol. 42, 885-888. 4. Quan Bin Zhang, Xiao Yan Ji, Qiang Huang, Jun Dong, Yu De Zhu, Qing Lan. 2006. Differentiation profile of brain tumor stem cells: a comparative study with neural stem cells. Cell Research 16:909-915. 5. Ichiro Nakano, and Harley I. Kornblum. 2006. Brain Tumor Stem Cells. Pediatric Research. Vol. 59, No. 4 6. Sharma S, Gurudutta GU, Satija NK, Pati S, Afrin F, Gupta P, Verma YK, Singh VK, Tripathi RP. Stem cell c-KIT and HOXB4 genes: critical roles and mechanisms in self-renewal, proliferation, and differentiation. Stem cells Dev 2006 Dec;15(6):755-78. 7. Anita C. Bellail, Stephen B. Hunter, Daniel J. Brat, Chalet Tan, Erwin G. Van Meir. 2004. Miccroregional extracellular matrix heterogeneity in brain modulates glioma cell invasion. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 1046-1069. 8. C. Hirschmann-Jax, A. E. Foster, G. G. Wulf, J. G. Nuchtern, T. W. Jax, U. Gobel, M. A. Goodell. 2004. A distinct „side population“ of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells. PNAS. Vol. 101, no.39. 9. Sheng Zhou, John D. Schuetz, Kevin D. Bunting, Anne-Marie Colapietro, Janardhan Sampath, John J. Morris, Irina Lagutina, Gerard C. Grosveld, Mitsujiro Osawa, Hiromitsu Nakauchi & Brian P. Sorrentino. 2001. The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype. Nature Medicine vol. 7, no. 9 10. Toru Kondo, Takao Setoguchi, and Tetsuya Taga. 2003. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma cell line. PNAS. Vol. 101, no. 3, 781-786.
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fiogf49gjkf0dCebadores específicos utilizados para RT-PCR">
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fiogf49gjkf0dCondiciones de los procesos de RT-PCR.">
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fiogf49gjkf0dRT-PCR para el gen c-KIT en líneas celulares de glioblastoma: Gel de agarosa de las líneas para el marcador c-KIT. M: Marcador de peso molecular 1Kb, 1: Control positivo (cDNA cerebro), 2: sangre, 3: agua, 4: A172, 5: GOS 3, 6: T98G, 7: LN 405, 8: SW1088, 9: SW1783, 10: CCF-STTG1, 11: MOG-G-CCM, 12: U-87 MG, 13: U118.">
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fiogf49gjkf0dAnálisis de metilación con Real Time PCR, representando la curva de Meeting. a) Color rojo: sangre (control negativo), Color verde: IMD (DNA Metilado in Vitro, control positivo), Color amarillo: agua, Color azul: línea U87 (no metilada), Color negro: línea GOS3 (metilada). b) Color rojo: sangre (control negativo), Color verde: IMD (DNA Metilado in Vitro, control positivo), Color azul: agua, Color negro: línea U87 (no metilada). Representación de las muestras por triplicado.">
fiogf49gjkf0dMarcaje con Hoechst 33342. a) Línea celular MOG-G-CCM sin marcar, por lo que toda la línea aparece representada en color azul y prácticamente sin emisión de fluorescencia b) Línea celular MOG-G-CCM incubada con Hoechst 33342 (en morado aparece lo que se correspondería con una baja fluorescencia emitida y se correspondería con la población SP y el color azul representaría el resto de la línea con células tumorales en la que hay diverso grado de emisión de la fluorescencia), c) Línea celular MOG-G-CCM incubada simultáneamente con Hoechst 33342 y con verapamil (en morado se aprecia la disminución de gran parte de la población SP, que ahora estaría incorporada con el resto de las células tumorales de color azul), d) Línea celular CCF-STTG1 sin marcar, e) Línea celular CCF-STTG1 marcada con Hoechst 33342 y f) Línea celular CCF-STTG1 incubada simultáneamente con verapamil, en la que se aprecia una disminución de la población.
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fiogf49gjkf0dDistintos porcentajes de la población SP obtenidos cuando las células son incubadas con Hoechst 33342 o con éste y con verapamil.">
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