Nº 770. Comunicación libre
|
Nelvys Subirós-Martínez[1], Rosa María Coro-Antich[1], Jorge Daniel García-Salman[1], Iliana Sosa-Testé[2], Yuneidys Mengana-Tamos[2], Julio César García-Rodríguez[2], A. Muñoz-Cernada[3], Y. Nuñez-Figueredo[3], Z. Pardo-Ruiz[3], J. Cruz-Rodríguez[4] |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
9;590;591;592;593;594;595;596;597;598;599;602;603;604;605;606;607;608;609;613;614;615;616;617;618;619;620;622;623;624;625;629;630;631;632;633;634;635;636;637;638;639;640;641;642;643;645;647;648;649;650;652;653;654;655;656;657;658;659;660;661;662;663;664;665;666;667;668;669;670;671;672;673;674;675;676;677;678;679;680;681;682;683;686;687;688;689;690;691;692;693;694;695;696;697;698;699;700;701;702;703;704;706;707;708;709;710;711;712;713;714;715;716;718;719;720;721;722;723;724;725;726;727;728;729;730;731;732;733;734;735;736;737;739;740;741;743;744;745;746;747;748;749;750;751;752;753;754;755;756;757;758;759;760;762;763;764;765;766;767;768;769;770;771;772;773;774;775;776;777;778;779;780;781;782;783;784;785;787;788;789;790;791;792;793;794;795;796;797;798;799;800;801;803;804;805;806;807;811;812;813;814;815;816;817;818;819;820;821;822;823;824;825;826;827;830;831;832;833;834;835;836;837;838;840;841;842;843;844;845;846;847;848;849;850;851;852;853;854;855;856;858;859;860;861;862;863;864;865;866;867;868;869;870;871;872;873;874;875;876;877;878;879;880;881;882;883;884;885;886;888;889;890;891;892;893;894;895;896;897;898;899;900;901;902;903;904;905;906;907;908;909;910;911;913;914;915;916;917;918;919;920;921;922;923;924;925;929;931;934;936;937;939;940;941;942;943;944;945;946;947;948;949;950;951;952;953;954;955;956;957;960;961;962;963;964;965;966;967;968;969;970;971;972;973;974;975;976;977;978;979;980;981;982;983;984;985;986;987;988;989;990;991;992;993;994;995;996;997;998;999;1000;1001;1002;1003;1004;1005;1006;1007;1008;1009;1010;1012;1013;1014;1015;1016;1017;1018;1019;1020;1021;1022;1023;1024;1025;1026;1027;1028;1029;1030;1031;1033;1034;1035;1036;1037;1038;1039;1040;1041;1042;1043;1044;1045;1046;1047;1048;1049;1050;1051;1052;1054;1055;1056;1057;1058;1059;1060;1061;1062;1063;1064;1065;1066;1067;1068;1069;1070;1071;1072;1073;1075;1076;1077;1078;1079;1080;1081;1082;1084;1085;1086;1087;1088;1089;1090;1091;1093;1094;1095;1096;1097;1098;1099;1100;1102;1103;1104;1105;1106;1107;1108;1109;1111;1112;1113;1114;1115;1116;1117;1118;1119;1120;1121;1122;1123;1124;1125;1126;1127;1128;1129;1130;1131;1132;1133;1134;1135;1136;1137;1138;1139;1140;1141;1142;1143;1144;1145;1146;1147;1148;1149;1150;1151;1152;1153;1154;1155;1156;1157;1158;1159;1160;1161;1162;1163;1164;1165;1166;1167;1168;1169;1170;1171;1172;1173;1174;1175;1176;1177;1178;1179;1180;1181;1182;1183;1184;1185;1186;1187;1188;1189;1190;1191;1192;1193;1194;1195;1196;1197;1198;1199;1200;1201;1202;1203;1204;1205;1206;1207;1208;1209;1210;1211;1212;1213;1214;1215;1216;1217;1218;1219;1220;1221;1222;1223;1224;1225;1226;1227;1228;1229;1230;1231;1232;1233;1234;1235;1236;1237;1238;1239;1240;1241;1242;1243;1244;1245;1246;1247;1248;1249;1250;1251;1252;1253;1254;1255;1256;1257;1258;1259;1260;1261;1262;1263;1264;1265;1266;1267;1268;1269;1270;1271;1272;1273;1274;1275;1276;1277;1278;1279;1280;1281;1282;1283;1284;1285;1286;1287;1288;1289;1290;1291;1292;1293;1294;1295;1296;1297;1298;1299;1300;1301;1302;1303;1304;1305;1306;1307;1308;1309;1310;1311;1312;1313;1314;1315;1316;1317;1318;1319;1320;1321;1322;1323;1324;1325;1326;1327;1328;1329;1330;1331;1332;1333;1334;1335;1336;1337;1338;1339;1340;1341;1342;1343;1344;1345;1346;1347;1348;1349;1350;1351;1352;1353;1354;1355;1356;1357;1358;1359;1360;1361;1362;1363;1364;1365;1366;1367;1368;1369;1370;1371;1372;1373;1374;1375;1376;1377;1378;1379;1380;1381;1382;1383;1384;1385;1386;1387;1388;1389;1390;1391;1392;1393;1394;1395;1396;1397;1398;1399;1400;1401;1402;1403;1404;1405;1406;1407;1408;1409;1410;1411;1412;1413;1414;1415;1416;1417;1418;1419;1420;1421;1422;1423;1424;1425;1426;1427;1428;1429;1430;1431;1432;1433;1434;1435;1436;1437;1438;1439;1440;1441;1442;1443;1444;1445;1446;1447;1448;1449;1450;1451;1452;1453;1454;1455;1456;1457;1458;1459;1460;1461;1462;1463;1464;1465;1466;1467;1468;1469;1470;1471;1472;1473;1474;1475;1476;1477;1478;1479;1480;1481;1482;1483;1484;1485;1486;1487;1488;1489;1490;1491;1492;1493;1494;1495;1496;1497;1498;1499;1500;1501;1502;1503;1504;1505;1506;1507;1508;1509;1510;1511;1512;1513;1514;1515;1516;1517;1518;1519;1520;1521;1522;1523;1524;1525;1526;1527;1528;1529;1530;1531;1532;1533;1534;1535;1536;1537;1538;1539;1540;1541;1542;1543;1544;1545;1546;1547;1548;1549;1550;1551;1552;1553;1554;1555;1556;1557;1558;1559;1560;1561;1562;1563;1564;1565;1566;1567;1568;1569;1570;1571;1572;1573;1574;1575;1576;1577;1578;1579;1580;1581;1582;1583;1584;1585;1586;1587;1588;1589;1590;1591;1592;1593;1594;1595;1596;1597;1598;1599;1600;1601;1602;1603;1604;1605;1606;1607;1608;1609;1610;1611;1612;1613;1614;1615;1616;1617;1618;1619;1620;1621;1622;1623;1624;1625;1626;1627;1628;1629;1630;1631;1632;1633;1634;1635;1636;1637;1638;1639;1640;1641;1642;1643;1644;1645;1646;1647;1648;1649;1650;1651;1652;1653;1654;1655;1656;1657;1658;1659;1660;1661;1662;1663;1664;1665;1666;1667;1668;1669;1670;1671;1672;1673;1674;1675;1676;1677;1678;1679;1680;1681;1682;1683;1684;1685;1686;1687;1688;1689;1690;1691;1692;1693;1694;1695;1696;1697;1698;1699;1700;1701;1702;1703;1704;1705;1706;1707;1708;1709;1710;1711;1712;1713;1714;1715;1716;1717;1718;1719;1720;1721;1722;1723;1724;1725;1726;1727;1728;1729;1730;1731;1732;1733;1734;1735;1736;1737;1738;1739;1740;1741;1742;1743;1744;1745;1746;1747;1748;1749;1750;1751;1752;1753;1754;1755;1756;1757;1758;1759;1760;1761;1762;1763;1764;1765;1766;1767;1768;1769;1770;1771;1772;1773;1774;1775;1776;1777;1778;1779;1780;1781;1782;1783;1784;1785;1786;1787;1788;1789;1790;1791;1792;1793;1794;1795;1796;1797;1798;1799;1800;1801;1802;1803;1804;1805;1806;1807;1808;1809;1810;1811;1812;1813;1814;1815;1816;1817;1818;1819;1820;1821;1822;1823;1824;1825;1826;1827;1828;1829;1830;1831;1832;1833;1834;1835;1836;1837;1838;1839;1840;1841;1842;1843;1844;1845;1846;1847;1848;1849;1850;1851;1852;1853;1854;1855;1856;1857;1858;1859;1860;1861;1862;1863;1864;1865;1866;1867;1868;1869;1870;1871;1872;1873;1874;1875;1876;1877;1878;1879;1880;1881;1882;1883;1884;1885;1886;1887;1888;1889;1890;1891;1892;1893;1894;1895;1896;1897;1898;1899;1900;1901;1902;1903;1904;1905;1906;1907;1908;1909;1910;1911;1912;1913;1914;1915;1916;1917;1918;1919;1920;1921;1922;1923;1924;1925;1926;1927;1928;1929;1930;1931;1932;1933;1934;1935;1936;1937;1938;1939;1940;1941;1942;1943;1944;1945;1946;1947;1948;1949;1950;1951;1952;1953;1954;1955;1956;1957;1958;1959;1960;1961;1962;1963;1964;1965;1966;1967;1968;1969;1970;1971;1972;1973;1974;1975;1976;1977;1978;1979;1980;1981;1982;1983;1984;1985;1986;1987;1988;1989;1990;1991;1992;1993;1994;1995;1996;1997;1998;1999;2000;2001;2002;2003;2004;2005;2006;2007;2008;2009;2010;2011;2012;2013;2014;2015;2016;2017;2018;2019;2020;2021;2022;2023;2024;2025;2026;2027;2028;2029;2030;2031;2032;2033;2034;2035;2036;2037;2038;2039;2040;2041;2042;2043;2044;2045;2046;2047;2048;2049;2050;2051;2052;2053;2054;2055;2056;2057;2058;2059;2060;2061;2062;2063;2064;2065;2066;2067;2068;2069;2070;2071;2072;2073;2074;2075;2076;2077;2078;2079;2080;2081;2082;2083;2084;2085;2086;2087;2088;2089;2090;2091;2092;2093;2094;2095;2096;2097;2098;2099;2100;2101;2102;2103;2104;2105;2106;2107;2108;2109;2110;2111;2112;2113;2114;2115;2116;2117;2118;2119;2120;2121;2122;2123;2124;2125;2126;2127;2128;2129;2130;2131;2132;2133;2134;2135;2136;2137;2138;2139;2140;2141;2142;2143;2144;2145;2146;2147;2148;2149;2150;2151;2152;2153;2154;2155;2156;2157;2158;2159;2160;2161;2162;2163;2164;2165;2166;2167;2168;2169;2170;2171;2172;2173;2174;2175;2176;2177;2178;2179;2180;2181;2182;2183;2184;2185;2186;2187;2188;2189;2190;2191;2192;2193;2194;2195;2196;2197;2198;2199;2200;2201;2202;2203;2204;2205;2206;2207;2208;2209;2210;2211;2212;2213;2214;2215;2216;2217;2218;2219;2220;2221;2222;2223;2224;2225;2226;2227;2228;2229;2230;2231;2232;2233;2234;2235;2236;2237;2238;2239;2240;2241;2242;2243;2244;2245;2246;2247;2248;2249;2250;2251;2252;2253;2254;2255;2256;2257;2258;2259;2260;2261;2262;2263;2264;2265;2266;2267;2268;2269;2270;2271;2272;2273;2274;2275;2276;2277;2278;2279;2280;2281;2282;2283;2284;2285;2286;2287;2288;2289;2290;2291;2292;2293;2294;2295;2296;2297;2298;22 Entre los posibles agentes neuroprotectores con perspectivas de uso clínico está la eritropoyetina (EPO), cuyos efectos se han documentado en modelos animales de isquemia cerebral y otras enfermedades del Sistema Nervioso. Para evitar la estimulación de la eritropoyesis, se crearon derivados de la EPO, entre ellos, la EPO humana recombinante con bajo contenido de ácidos siálicos (EPOhr-bas).
El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto neuroprotector de una formulación específica de EPOhr-bas administrada por vía nasal, en un modelo de isquemia cerebral focal en gerbos de Mongolia.
Se escogió la vía nasal porque en los últimos años se ha considerado como una vía rápida y directa al encéfalo, pues logra evadir la barrera hematoencefálica.
Se establecieron 3 grupos de animales (controles, isquémicos tratados con el vehículo de la formulación e isquémicos tratados con EPOhr-bas). Se evaluó el estado neurológico a las 24 horas y la conducta exploratoria a los 7 días. Los encéfalos se procesaron para microscopía óptica.
El tratamiento nasal con EPOhr-bas redujo la mortalidad, mejoró el estado neurológico de los animales a las 24 horas, disminuyó la discapacidad cognitiva inducida por isquemia cerebral y redujo el daño histológico en el sector CA3 del hipocampo, corteza temporal y tálamo. Los resultados de este trabajo sugieren que la formulación de EPOhr-bas administrada por vía nasal llega al encéfalo y ejerce efectos neuroprotectores en este modelo.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
Hay dos estrategias terapéuticas específicas ante el ictus isquémico agudo. La primera se basa en restaurar el flujo sanguíneo y la segunda en aumentar la sobrevivencia de las células del tejido nervioso ante la disminución del flujo sanguíneo (neuroprotección).
Sin embargo, hasta el momento no existen drogas neuroprotectoras lo suficientemente efectivas, específicas y seguras para el tratamiento de la isquemia cerebral aguda o crónica 1. Varios compuestos que se habían mostrado como promesas terapéuticas en estudios con animales no han tenido el mismo éxito en la clínica 2, 3.
Luego de un insulto isquémico al sistema nervioso central (SNC), se activan mecanismos de defensa entre los cuales está la síntesis de neuroprotectores endógenos 4. Tal es el caso de la eritropoyetina (EPO), cuya expresión en el tejido nervioso se ha descubierto recientemente 5.
La idea de administrar moléculas endógenas neuroprotectoras podría ser una estrategia terapéutica con buenos resultados en el tratamiento del daño cerebral 6. Los efectos de la EPO humana recombinante (EPOhr) se han estudiado en modelos animales de isquemia cerebral, en los cuales se ha observado reducción del volumen del infarto y menor disfunción neurológica y cognitiva 7, 8. Un estudio en humanos con ictus isquémico agudo mostró que el tratamiento con EPOhr endovenosa mejoró el estado neurológico de los pacientes tratados con respecto a los controles 9.
El efecto neuroprotector de la EPOhr involucra mecanismos de inhibición de la apoptosis, disminución del estrés oxidativo y modulación de la excitabilidad neuronal, entre otros 10, 11.
Hasta el momento la administración endovenosa de EPOhr ha sido la ruta de elección. Sin embargo, como la EPOhr tiene un tiempo de vida media en plasma de 5,6 horas, existe el riesgo de estimular la eritropoyesis, lo cual podría dificultar el uso clínico de esta molécula 12.
Una alternativa es emplear una molécula de EPOhr con bajo contenido de ácidos siálicos (EPOhr-bas), similar a la producida de forma endógena en el cerebro durante la hipoxia 13. Esta nueva molécula tiene la ventaja de una eliminación periférica más rápida. Además, se ha reportado que no aumenta el hematocrito y mantiene un amplio espectro de propiedades neuroprotectoras en roedores 14, 15.
La EPOhr administrada por vía sistémica debe atravesar la barrera hematoencefálica (BHE), por lo cual se necesitan dosis muy altas para proteger el tejido nervioso 16. Tales cantidades tienen el efecto indeseado de estimular la eritropoyesis 17, 18. Sería ideal establecer una vía alternativa mediante la cual pequeñas dosis fueran suficientes para el tratamiento de condiciones que necesitan administraciones repetidas del fármaco. También es importante disminuir el tiempo en que la molécula llega al encéfalo ya que en el ictus isquémico agudo el tiempo es un factor crítico para la protección del tejido nervioso.
En los años recientes la administración nasal ha ganado importancia como vía de entrada de agentes terapéuticos al encéfalo 19. Aunque todavía no se conocen bien los mecanismos de transporte a través de la vía nasal, se postula que existe un paso directo desde la región olfatoria hacia el parénquima cerebral y líquido cefalorraquídeo, sin tener que atravesar la BHE 20, 21. Además, se ha comprobado que la vía nasal es más rápida que la endovenosa 22, 23.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
Animales: Se emplearon gerbos de Mongolia machos (entre 60 y 80 g de peso), procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio. El protocolo se analizó y aprobó por el Comité de Ética Institucional 24. Todos los animales tuvieron libre acceso al agua y al alimento, con un ciclo de 12 horas luz / oscuridad.
Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 3 grupos experimentales: un grupo control al que solamente se les aisló la arteria carótida común derecha (Control; n=30); un grupo isquémico que se trató con el vehículo de la formulación (IT-V; n=59) y un grupo isquémico que se trató con EPOhr-bas (IT-EPO; n=49).
Formulación nasal de EPOhr-bas: La EPOhr-bas fue suministrada por el Centro de Inmunología Molecular (La Habana), a una concentración entre 0.5 y 1.5 mg/ml.. Se empleó el polímero bioadhesivo D-hidroxi-propilcelulosa, para aumentar el tiempo de residencia de la formulación en la cavidad nasal y disminuir su eliminación por el movimiento ciliar. Se utilizó un buffer para estabilizar el pH, preservo e isotonizante (patente SP #20050138) 25. En lo adelante las referencias al vehículo incluyen todos los componentes de la formulación excepto la EPOhr-bas.
Procedimiento quirúrgico: Los animales se anestesiaron por vía intraperitoneal con una mezcla de ketamina-atropina-diazepam. El modelo de isquemia cerebral se llevó a cabo según el método de Butterfield y McGraw 26. Se ligó la arteria carótida común en un punto proximal y otro distal del tramo visible de la arteria y se cortó por el segmento intermedio entre ambas ligaduras (Fig. 1).
Administración de la EPOhr-bas: Se administraron 30ml diarios (durante 4 días) de la formulación de EPOhr-bas ó un volumen correspondiente del vehículo, alternando entre ambas fosas nasales.
Evaluación de la mortalidad: Se registró la mortalidad hasta los 7 días post- operatorios. Los datos se sometieron al análisis de Kaplan – Meier seguido por la prueba de log-rank.
Evaluación del estado neurológico: A las 24 horas de la operación se determinaron los signos clínicos de infarto. Se utilizaron los criterios de Lawner y cols. 27 para establecer una escala cuantitativa. A la puntuación que alcanzó cada animal se le denominó Grado Neurológico (GN) (Tabla 1). Los datos de GN se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Mann-Whitney cuando hubo significación estadística.
Evaluación conductual: A los 7 días de la operación se registró la actividad exploratoria que manifiestan los animales cuando se colocan en un ambiente nuevo ( “open field”, en lo adelante “campo abierto” 28). Se contó el número de empinamientos durante 9 minutos, subdivididos en 3 intervalos. Se compararon los valores de las pendientes de las rectas de mejor ajuste (rectas de habituación) con la prueba de Kruskal-Wallis seguida por la de Mann-Whitney.
Evaluación histológica: A los 7 días los gerbos se perfundieron por vía transcardíaca con solución fisiológica, seguida de solución neutra de formaldehído al 10%. Los encéfalos se extrajeron y se mantuvieron en la solución fijadora durante 1 semana. Se tomaron dos secciones coronales de 2 mm cada una: una a nivel del núcleo caudado-putamen (a +0.1 de Bregma) y otra a nivel del hipocampo dorsal (a –1.6 mm de Bregma) 29. Las secciones de cerebro se incluyeron en parafina, se hicieron cortes de 4 mm y se tiñeron con hematoxilina-eosina. También se empleó la tinción de Luxol Fast Blue para verificar la pérdida de mielina.
Estudio cualitativo: Las láminas se evaluaron a ciegas. Se estudiaron la corteza parietal y temporal, CA1, CA2, CA3, CA4 del hipocampo, núcleos del tálamo y núcleo caudado-putamen, además de hacer una valoración general de todo el corte (Fig. 2).
Estudio semicuantitativo: Se confeccionó una escala para evaluar el estado histológico en las regiones antes mencionadas. A cada región se le asignó entre 0 y 3 puntos, equivalentes a ningún daño (0), y daños ligero (1), moderado (2) y severo (3). A la puntuación que alcanzó cada animal se le denominó Grado Histológico (GH). Estos datos se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Mann-Whitney cuando hubo significación estadística.
Estudio cuantitativo: Sin conocimiento previo de la identificación de las láminas, se contaron las neuronas piramidales del sector CA1 del hipocampo dorsal de ambos hemisferios. Se consideraron sanas aquellas neuronas con núcleo redondeado, cromatina laxa, de tamaño relativamente grande y no eosinofílicas. Se consideraron neuronas dañadas aquellas que presentaron cariolisis, carriorrexis, eosinofilia, picnosis y/o encogimiento del cuerpo neuronal. En todos los casos se analizaron 2 campos consecutivos de 314 µm de longitud por cada hemisferio. Para la morfometría se utilizó el programa ImageJ 1.34s 30. Las densidades lineales de neuronas sanas se compararon entre hemisferios y entre grupos (Kruskal-Wallis y Mann-Whitney).
Análisis estadístico: Se utilizó el programa Microsoft STATISTICA versión 6.0, aceptando un nivel de significación de 0.05.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
Mortalidad:
La aplicación nasal de EPOhr disminuyó la mortalidad en comparación con el grupo isquémico tratado con vehículo (Fig. 3). Estos dos grupos mostraron diferencias significativas con respecto al control.
Evaluación del estado neurológico: En los animales del grupo control no se registraron manifestaciones clínicas de daño cerebral. El grado neurológico fue menor en los animales IT-EPO que en los IT-V; estos dos grupos se diferenciaron del control (Fig. 4).
En este modelo de isquemia unilateral en el gerbo, no todos los animales presentaron lesiones cerebrales isquémicas comprobadas al microscopio óptico (Tabla 2). En lo adelante se distinguirán las categorías de animal con lesión histológica y animal sin lesión histológica.
Los gerbos con mayores valores de GN mostraron deterioro no solo en las extremidades contralaterales sino también en las ipsolaterales. Estos animales murieron entre las 48 y 72 horas después de la operación.
Evaluación conductual:
En el análisis de las pendientes de las rectas de habituación de todos los animales se obtuvieron valores más negativos para los grupos control e IT-EPO, con respecto al grupo IT-V (Fig. 5).
Evaluación histológica Estudio cualitativo: En la observación de las láminas de los animales controles no se apreció daño histológico. En 5 animales del grupo IT-V se observó un área de infarto en el hemisferio ipsolateral a la oclusión de la carótida. La zona infartada se extendió a todas las regiones del hipocampo (incluyendo gran parte del giro dentado) (Fig. 6-b,e,h), a la corteza parietal y temporal (Fig. 7-b,e,h,k), a núcleos del tálamo (Fig. 8-b,e,h) y caudado-putamen y (Fig. 9-c). En el sector CA1 del hipocampo las neuronas piramidales se observaron picnóticas, retraídas y con citoplasma acidófilo (Fig. 6-e). En el área infartada se observaron corpúsculos granulo-grasosos (macrófagos) llenos de productos de degradación de la mielina (Fig. 9). Los macrófagos, algunos binucleados y en procesos de mitosis (Fig. 8-h y 9), formaban agrupaciones, principalmente en núcleos del tálamo y en el caudado-putamen.
En los animales IT-V sin lesión histológica se encontraron aisladas células picnóticas en el hipocampo y corteza cerebral. En el grupo IT-EPO hubo 6 animales con lesiones histológicas. En 3 de ellos solo hubo daño ligero en las regiones CA1 y CA2 del hipocampo. En los 3 animales restantes se observaron áreas de infarto en el hipocampo, corteza parietal (Fig. 6 y 7) y núcleo caudado-putamen. La zona del infarto fue menos extensa en los animales del grupo IT-EPO que en los animales IT-V (Fig. 6, 7 y 8).
Estudio semicuantitativo:
Los animales IT-EPO con lesión histológica mostraron menores valores del GH que los IT-V, a expensas de CA3, tálamo y corteza temporal del hemisferio ipsolateral (Tabla 2). En los animales sin lesiones histológicas no se encontraron diferencias significativas en el GH ni en las variables que lo integran (Tabla 2).
Tabla 2. Evaluación semicuantitativa. Valores promedio de la puntuación por áreas (*: p<0.05 con respecto a IT-V con lesión histológica). Pruebas de Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney. Estudio cuantitativo: La densidad de neuronas sanas de los hemisferios contralaterales (izquierdos) fue igual en los 3 grupos. En el hemisferio ipsolateral a la oclusión, la densidad de neuronas sanas en CA1 fue menor en los animales con lesión histológica de los grupos isquémicos que en el grupo control. No se encontraron diferencias entre los grupos IT-V e IT-EPO (Tabla 3). La densidad de neuronas sanas de CA1 ipsolateral en los animales sin lesiones histológicas no arrojó diferencias entre los 3 grupos.
Control IT-V IT-EPO HI HD HI HD HI HD 229± 21 232 ± 17 Con lesión histológica 253±31 4±5 * 218±29 11±11 * Sin lesión histológica 233±35 223±24 222±23 212±29 Todos 239±34 155± 107 221±23 174±85 Tabla 3. Densidades lineales de neuronas sanas en el sector CA1 del hipocampo. Valores promedio en neuronas/mm. HI: hemisferio izquierdo; HD: hemisferio derecho. Prueba de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney (*: p<0.05, diferencia con el HD control). El porciento de daño en el sector CA1 del hipocampo ipsolateral, calculado como:
% de daño = Número de neuronas dañadas * 100 Número de neuronas sanas + dañadas se correlacionó de forma directa con la evaluación semicuantitativa de esa región (r=0.56; p<0.01). Se encontró correlación positiva entre el GN y el GH del hemisferio ipsolateral. El GN también se correlacionó con el daño histológico en todas las áreas cerebrales. No se encontró correlación entre ninguna de las variables histológicas con la variable conductual.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
El modelo de oclusión unilateral permanente de la arteria carótida común se ha empleado en el estudio de la fisiopatología de la isquemia cerebral focal y en la evaluación de posibles agentes neuroprotectores 31-33.
En este modelo se han reportado tasas de mortalidad de 25 a 50% entre las 24 y 48 horas post-isquémicas 34, 35. De acuerdo con nuestros resultados, 29% y 56% de los gerbos del grupo IT-V murieron a las 24 horas y 7 días respectivamente, lo que concuerda con la literatura consultada.
En la evaluación del estado neurológico se confirmó daño funcional en los IT-V, para los cuales el GN fue mayor que en los controles y los tratados con EPOhr-bas. Yu y cols 36 también observaron un mejoramiento del estado neurológico en ratas con isquemia focal, luego de tratarlas con EPOhr por vía nasal.
La EPOhr se ha asociado a una preservación de la capacidad de aprendizaje en animales isquémicos 37, 38. La similitud conductual observada en este trabajo entre los animales controles y los IT-EPO, demuestra la efectividad de esta formulación para contrarrestar los efectos agudos de la isquemia cerebral. El hecho de que la EPOhr-bas atenuó la discapacidad de aprendizaje inducida por la isquemia podría explicarse por su efecto de mejorar la transmisión sináptica durante la isquemia. Esto último se ha demostrado en un modelo in vitro 39. También se ha postulado que la EPOhr estimula la función y la viabilidad neuronal a través de la activación de canales de calcio y la liberación de neurotransmisores 40.
En un número no despreciable de animales del grupo IT-V (21 de 26 sobrevivientes) no se observaron evidencias de infarto u otra lesión al examen microscópico, lo cual es característico del modelo de isquemia unilateral permanente en gerbos. Estos hallazgos coinciden con Payan y Conrad 41, quienes encontraron que 26 de 28 animales no mostraron lesiones cerebrales isquémicas después de la operación.
La ausencia de lesión podría deberse a una compensación del flujo sanguíneo por la arteria carótida izquierda, lo cual sugiere un polígono de Willis con mayor cantidad de anastomosis 42. Se propone que hay un estado de hipoperfusión crónica en el hemisferio ipsolateral a la oclusión, en el cual el flujo sanguíneo está por encima del umbral de la isquemia, pero por debajo de los niveles normales 43. Considerando que los animales isquémicos sin lesión histológica presentaron afectación del estado neurológico y de la capacidad cognitiva, se pudiera pensar que el tejido cerebral, aunque estructuralmente se observó intacto, bioquímicamente sí estaba comprometido 44.
En este trabajo, en los animales con lesión histológica se observó un efecto neuroprotector de la EPOhr-bas reflejado en un menor GH. El análisis por áreas demostró que la neuroprotección se pone de manifiesto en las regiones CA3 del hipocampo, tálamo y corteza temporal, regiones que constituyen las fronteras del infarto.
En este trabajo, las estructuras en las que se observó neuroprotección (CA3, tálamo y corteza temporal) se encuentran en la periferia del infarto, por lo que probablemente en las primeras horas después de la oclusión constituyeron el área de penumbra. Probablemente la llegada de la EPOhr-bas a la región de penumbra protegió a esas células contra fenómenos como la excitotoxicidad y apoptosis 45. Además, se ha demostrado que la EPOhr-bas estimula procesos de angiogénesis y neurogénesis 46-48, lo que proporciona un microambiente favorable para la plasticidad neuronal durante la recuperación del ictus.
En la región CA1 del hipocampo no se observaron efectos neuroprotectores, lo cual se corroboró con el estudio de las densidades neuronales. Esta zona del hipocampo es una de las más sensibles a la isquemia 49, 50, por lo que el efecto neuroprotector de cualquier fármaco tendría menores posibilidades de evidenciarse que en zonas menos vulnerables. La menor afectación histológica de CA3 y núcleos talámicos en animales tratados con EPOhr-bas ilustra lo expuesto anteriormente.
La vía nasal da la posibilidad de administrar dosis mucho menores que las necesarias por vía endovenosa. En modelos animales con administración intraperitoneal de EPOhr se establecen dosis generalmente entre 1000 y 5000 U/kg 51-53. La dosis establecida en este trabajo es mucho más baja (187U/kg por aplicación). Estos resultados sugieren que la EPOhr-bas nasal puede tener un beneficio terapéutico sobre el daño agudo después de una isquemia cerebral focal, aplicando menores dosis.
Sosa y cols. 36, 54, 55 demostraron el paso de la EPOhr-bas a través de la vía nasal al SNC. Su detección, tanto en los bulbos olfatorios como en el cerebelo, ha sugerido el contacto de la molécula con el LCR. Esto último podría representar una ventaja práctica para alcanzar zonas con riego sanguíneo deficiente 54.
En este modelo de isquemia focal se demostró que la EPOhr-bas aplicada por vía nasal atenúa el deterioro post-isquémico cerebral. Este efecto neuroprotector se evidenció por la reducción de la mortalidad, el mejoramiento del estado neurológico a las 24 horas, la no afectación de la capacidad cognitiva y la reducción del daño histológico. Los resultados de este trabajo constituyen una evidencia indirecta del paso de la molécula de EPOhr-bas al SNC a través de la cavidad nasal. Esto abriría nuevas posibilidades terapéuticas para estimular la regeneración del tejido y la recuperación de áreas cerebrales usando un método seguro y no invasivo, como es la vía nasal.
El perfil de seguridad y efectividad de la EPOhr en varios modelos de enfermedades neurológicas, la convierten en un compuesto candidato a terapéutico de primera línea para emergencias neurológicas. Incluso podría administrarse de forma segura en un escenario de emergencia pre-hospitalaria, para luego complementar con otros compuestos farmacéuticos más específicos de la enfermedad.
Se puede aseverar que la vía nasal constituye una alternativa de acceso de la EPOhr al encéfalo, y la molécula con bajo contenido de ácidos siálicos tiene suficiente eficacia terapéutica en el tratamiento de la isquemia cerebral.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
El tratamiento con la formulación de EPOhr-bas por vía nasal mejora el estado funcional y estructural del SNC luego de una lesión isquémica unilateral permanente en gerbos de Mongolia.
La formulación de EPOhr-bas es capaz de llegar al encéfalo mediante la vía nasal y proteger del daño por isquemia focal y global a ciertas regiones cerebrales.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
1. Lipton P. Ischemic cell death in brain neurons. Physiol Rev 1999:79: 1431-1568.
2. Cheng YD, Al-Khoury L, Zivin JA. Neuroprotection for Ischemic Stroke: Two Decades of Successand Failure. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics 2004:1: 36-45.
3. DeBow SB, Clark DL, Maclellan CL, Colbourne F. Incomplete assessment of experimental cytoprotectants in rodent ischemia studies. Can J Neurol Sci 2003:30: 368-374.
4. Dirnagl U, Simon RP, Hallenbeck JM. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends Neurosci 2003:26: 248-254.
5. Digicaylioglu M, Bichet S, Marti HH et al. Localization of specific erythropoietin binding sites in defined areas of the mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A 1995:92: 3717-3720.
6. Dirnagl U, Simon RP, Hallenbeck JM. Ischemic tolerance and endogenous neuroprotection. Trends Neurosci 2003:26: 248-254.
7. Buemi M, Cavallaro E, Floccari F et al. The pleiotropic effects of erythropoietin in the central nervous system. J Neuropathol Exp Neurol 2003:62: 228-236.
8. Buemi M, Grasso G, Corica F et al. In vivo evidence that erythropoietin has a neuroprotective effect during subarachnoid hemorrhage. Eur J Pharmacol 2000:392: 31-34.
9. Ehrenreich H, Hasselblatt M, Dembowski C et al. Erythropoietin therapy for acute stroke is both safe and beneficial. Mol Med 2002:8: 495-505.
10. Weiss MJ. New insights into erythropoietin and epoetin alfa: mechanisms of action, target tissues, and clinical applications. Oncologist 2003:8 Suppl 3:18-29.: 18-29.
11. Siren AL, Ehrenreich H. Erythropoietin--a novel concept for neuroprotection. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 2001:251: 179-184.
12. Erbayraktar S, Grasso G, Sfacteria A et al. Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2003:100: 6741-6746.
13. Masuda S, Okano M, Yamagishi K, Nagao M, Ueda M, Sasaki R. A novel site of erythropoietin production. Oxygen-dependent production in cultured rat astrocytes. J Biol Chem 1994:269: 19488-19493.
14. Erbayraktar S, Grasso G, Sfacteria A et al. Asialoerythropoietin is a nonerythropoietic cytokine with broad neuroprotective activity in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2003:100: 6741-6746.
15. Wang X, Zhu C, Wang X et al. The nonerythropoietic asialoerythropoietin protects against neonatal hypoxia-ischemia as potently as erythropoietin. J Neurochem 2004:91: 900-910.
16. Brines M, Ghezzi P, Keenan S et al. Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury. PNAS 2000:97: 10526-10531.
17. Grasso G, Sfacteria A, Cerami A, Brines M. Erythropoietin as a tissue-protective cytokine in brain injury: what do we know and where do we go? Neuroscientist 2004:10: 93-98.
18. Wiessner C, Allegrini PR, Ekatodramis D, Jewell UR, Stallmach T, Gassmann M. Increased cerebral infarct volumes in polyglobulic mice overexpressing erythropoietin. J Cereb Blood Flow Metab 2001:21: 857-864.
19. Graff CL, Pollack GM. Nasal drug administration: potential for targeted central nervous system delivery. J Pharm Sci 2005:94: 1187-1195.
20. Graff CL, Pollack GM. Nasal drug administration: potential for targeted central nervous system delivery. J Pharm Sci 2005:94: 1187-1195.
21. Illum L. Nasal drug delivery--possibilities, problems and solutions. J Control Release 2003:87: 187-198.
22. Illum L. Nasal drug delivery--possibilities, problems and solutions. J Control Release 2003:87: 187-198.
23. Illum L. Nasal drug delivery: new developments and strategies. Drug Discov Today 2002:7: 1184-1189.
24. ILAR. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington , D.C.: National Academy Press,1996.
25. Muñoz Cernuda, A., León Rodríguez, R., García Rodríguez, J. C., Nuñez Figueredo, Y., Pardo Ruiz, Z., García Salman, J. D., Sosa, I., Curbelo Rodríguez, D., Cruz Rodríguez, J., and Subiros Martínez, N. Formulaciones nasales de EPOhr con bajo contenido de ácido siálico para el tratamiento de enfermedades del Sistema Nervioso Central. (20050138). 22-7-0005. Cuba.
Ref Type: Patent 26. Buterfield JD, Mcgraw CP. Efect of the DPPD (diphenyl-para-phenylendiamine) on stroke and cerebral edema in gerbils. Stroke 1978:9.
27. Lawner P, Laurent J, Simeone F, Fink E, Rubin E. Attenuation of ischemic brain edema by pentobarbital after carotid ligation in the gerbil. Stroke 1979:10: 644-647.
28. Colbourne F, Auer RN, Sutherland GR. Behavioral testing does not exacerbate ischemic CA1 damage in gerbils. Stroke 1998:29: 1967-1970.
29. Loskota WJ, Lomax P, Verity MA. A stereotaxic atlas of the Mongolian gerbil brain (Meriones unguiculatus). Los Angeles, California: Ann Arbor Science,1973.
30. Rasband, W. ImageJ. (1.34s). 2006. National Institutes of Health,USA.
Ref Type: Computer Program 31. Traystman RJ. Animal Models of Focal and Global Cerebral Ischemia. ILAR Journal 2003:44: 85-95.
32. Castro Pacheco A, Niembro E, Pérez Pérez V, Hernández García J, Grijalba I. Comunicación arterial carotidobasilar en gerbos (Meriones unguiculatus). Rev Neurol 2001;32(3): 225-228. Revista de Neurología 2001:32: 225-228.
33. Hossmann K-A. Experimental models for the investigation of brain ischemia. Cardiovascular Research 1998:39: 106-120.
34. Somova LI, Gregory MA, Nxumalo EN. Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) as a model of cerebral infarction for testing new therapeutic agents. Methods Find Exp Clin Pharmacol 2000:22: 203-210.
35. Pelliccioli GP, Gambelunghe C, Ottaviano PF, Iannaccone S, Ambrosini MW. Variable response of the Mongolian gerbil to unilateral carotid occlusion: magnetic resonance imaging and neuropathological characterization. Ital J Neurol Sci 1995:16: 517-526.
36. Yu Y-P, Xu Q-Q, Zhang Q, Zhang W-P, Zhang L-H, Wei E-Q. Intranasal recombinant human erythropoietin protects rats against focal cerebral ischemia. Neuroscience Letters 2005:387: 5-10.
37. Sadamoto Y, Igase K, Sakanaka M et al. Erythropoietin prevents place navigation disability and cortical infarction in rats with permanent occlusion of the middle cerebral artery. Biochem Biophys Res Commun 1998:253: 26-32.
38. Catania MA, Marciano MC, Parisi A et al. Erythropoietin prevents cognition impairment induced by transient brain ischemia in gerbils. Eur J Pharmacol 2002:437: 147-150.
39. Weber A, Maier RF, Hoffmann U et al. Erythropoietin improves synaptic transmission during and following ischemia in rat hippocampal slice cultures. Brain Res 2002:958: 305-311.
40. Marti HH. Erythropoietin and the hypoxic brain. J Exp Biol 2004:207: 3233-3242.
41. Payan HM, Conrad JR. Carotid ligation in gerbils. Influence of age, sex, and gonads. Stroke 1977:8: 194-196.
42. Castro-Pacheco A, Foyo-Niembro E, Perez-Perez V, Garcia-Hernandez J, Grijalva I. [Carotid-basilar artery communication in gerbils (Meriones unguiculatus)]. Rev Neurol 2001:32: 225-228.
43. Sosa, I., García Salman, J. D., Rodríguez, Y., Subiros, N., Rodríguez, K., and Thomas, A. Sensibilidad de los modelos de isquemia global y focal en el gerbil de Mongolia. http//www.Ilustrados.com:EyFpAVAlpCfBOoWnY . 2007.
Ref Type: Electronic Citation 44. Graham D, Lantos P. Greenfield´s Neuropathology, Vol I, Sixth edn. New York:1997.
45. Siren AL, Fratelli M, Brines M et al. Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress. Proc Natl Acad Sci U S A 2001:98: 4044-4049.
46. Shingo T, Sorokan ST, Shimazaki T, Weiss S. Erythropoietin regulates the in vitro and in vivo production of neuronal progenitors by mammalian forebrain neural stem cells. J Neurosci 2001:21: 9733-9743.
47. Marti HH, Bernaudin M, Petit E, Bauer C. Neuroprotection and angiogenesis: Dual role of erythropoietin in brain ischemia. News Physiological Sciences 2000:15: 225-229.
48. Wang L, Zhang Z, Wang Y, Zhang R, Chopp M. Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats. Stroke 2004:35: 1732-1737.
49. Kirino T, Sano K. Fine structural nature of delayed neuronal death following ischemia in the gerbil hippocampus. Acta Neuropathol (Berl) 1984:62: 209-218.
50. Kirino T, Sano K. Selective vulnerability in the gerbil hippocampus following transient ischemia. Acta Neuropathol (Berl) 1984:62: 201-208.
51. Siren AL, Fratelli M, Brines M et al. Erythropoietin prevents neuronal apoptosis after cerebral ischemia and metabolic stress. Proc Natl Acad Sci U S A 2001:98: 4044-4049.
52. Grasso G. Neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin in experimental subarachnoid hemorrhage. J Neurosurg Sci 2001:45: 7-14.
53. Villa P, Bigini P, Mennini T et al. Erythropoietin selectively attenuates cytokine production and inflammation in cerebral ischemia by targeting neuronal apoptosis. J Exp Med 2003:198: 971-975.
54. Sosa I, García Rodríguez JC, Santana J et al. Intranasal administration of recombinant human Erythropoietin exerts neuroprotective effects on post-ischemic brain injury in Mongolian gerbils. Pharmacologyonline 2006:1: 100-112.
55. Subiros Martínez, N., García Rodríguez, J. C., González Navarro, B., Sosa, I., and García Salman, J. D. Evaluación histológica del efecto de la Eritropoyetina vía intranasal, sobre la muerte neuronal retardada en gerbos sometidos a isquemia cerebral transitoria. Estudio preliminar. VII Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica . 2005.
Ref Type: Electronic Citation
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
- Mª TERESA CORCUERA PINDADO (17/05/2007 9:57:50)
- Rosa María Coro Antich (23/05/2007 22:12:15)
- Mirta Garcia Jardon (30/05/2007 12:18:07)
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
fiogf49gjkf0dFigura 2. Esquema de encéfalo de gerbil de Mongolia en los dos niveles estudiados. A: +0.1mm de Bregma. B: -1.6mm de Bregma. Hemisferio derecho: Tinción con Hematoxilina férrica. Hemisferio izquierdo: Esquema de las estructuras que se observan en cada nivel con algunas regiones identificadas.">
fiogf49gjkf0dFigura 3. Mortalidad de los animales a lo largo del experimento (prueba de Kaplan-Meier).">
fiogf49gjkf0dFigura 4. Grado neurológico en los grupos experimentales. Debajo de cada columna aparece la cantidad de animales. Prueba de Kruskal-Wallis y U de Mann-Whitney (*: p<0.05 con respecto al IT-V).">
fiogf49gjkf0dFigura 5. Media y desviaciones estándar de las proporciones de empinamientos en cada tercio de tiempo en el campo abierto con las rectas de mejor ajuste para cada grupo (prueba de Kruskal-Wallis).">
fiogf49gjkf0dFigura 6. Hipocampo dorsal. La isquemia provoca infarto en el hipocampo a los 7 días después de la oclusión (B,E,H). La EPOhr-bas protege el sector CA3 del hipocampo dorsal en este modelo (C,I) y no protege CA1 (F). Hematoxilina - Eosina.
A,B,C: Vista panorámica. Flecha: conservación de las neuronas de CA3.
D,E,F: Sector CA1 del hipocampo dorsal. Flechas: neuronas retraídas, con núcleos picnóticos y citoplasma eosinófilo.
G,H,I: Sector CA3 del hipocampo.
Cabezas de flecha en E, F y H: macrófagos con citoplasma vacuolado.
">
fiogf49gjkf0dFigura 7. Corteza parietal y temporal. La isquemia unilateral produce infarto en las cortezas parietal (B) y temporal (E, H, K). La EPOhr-bas rescata neuronas en la corteza temporal (F, I, L). Hematoxilina - Eosina.
A,B,C: Vista panorámica de la corteza parietal. hc: hipocampo; cc: cuerpo calloso; vL: ventrículo lateral. D,E,F: Vista panorámica de la corteza temporal. G,H,I: Capas más externas de la corteza temporal. H: Pérdida de los elementos neurales con espacios vacíos. I: Aspecto semejante al control. J, K, L: Capas más profundas de la corteza temporal. K: Pérdida de los elementos neurales con espacios vacíos. L: Aspecto semejante al control.
">
.jpg)
fiogf49gjkf0dFigura 8. Tálamo. La isquemia unilateral produce grandes acúmulos de macrófagos en núcleos del tálamo (B,E,H). El daño en tálamo disminuye con la EPOhr-bas (C, F, I). Hematoxilina - Eosina.
A,B,C: Vista panorámica. Flecha: acúmulo de macrófagos. VL: ventrículo lateral; hc: hipocampo.
D,E,F: Tálamo x400. E: foco de macrófagos. F: aspecto semejante al control.
G,H,I: Tálamo x1000. H: Macrófago con citoplasma vacuolado (cabeza de flecha); macrófago en mitosis (asterisco). I: Aspecto semejante al control.">
Web mantenido y actualizado por el Servicio de informática uclm. Modificado: 16/06/2015 17:19:20