Biopsia de medula ósea extracción y procesamiento en el laboratorio de anatomía patologica

Francisco Borja Gutierrez Corres (TEAP)^[1], Consuelo Izcara Melgosa (DUE)^[1], Consuelo Del Campo Clemente (TEAP)^[2], Elisa Cuero Ruiz (TEAP)^[2], Maria Perez de Albeniz Vesga (DUE)^[3], Maria Gloria Diaz Foncea (DUE)^[2]
(1) Hospital Galdakao ESPAÑA
(2) Hospital Galdakao ESPAÑA
(3) Hospital Cruces ESPAÑA

Resumen

Introduccion    

La medula ósea es un tipo de tejido que se encuentra en las cavidades de los huesos del organismo y se encarga de producir componentes de la sangre (hematopoyesis), porque contiene las células madre que originan los tres tipos de células sanguíneas: leucocitos (elementos principales del sistema inmunológico del organismo), hematíes y plaquetas.

La medula ósea puede ser de dos tipos:

-Medula ósea roja, que ocupa el tejido esponjoso de los huesos planos, como el esternón, las vértebras, la pelvis y las costillas.

-Medula ósea amarilla, que es el tejido adiposo y se localiza en los canales medulares de los huesos largos.

El examen de medula ósea es un procedimiento diagnostico especializado de suma importancia no solo para la evaluación y manejo de desordenes hematológicos malignos y no malignos, sino también para el seguimiento de neoplasias hematológicas y tumores sólidos.

La extracción de la medula ósea se realiza en los huesos planos. Los más habituales son el manubrio esternal y cresta iliaca anterior y posterior. También se puede realizar en las costillas, vértebras.

Si queremos extraer una biopsia ósea es mejor realizarla después de la aspiración y en un lugar distinto, pues la estructura de la medula ósea puede ser alterada después de la aspiración

Material y Métodos    

Método de extracción de la muestra

Una vez elegida la zona, se realiza una desinfección y se anestesia la zona con anestesia local. Se introduce una aguja d e 15 G. Tras pasar la cortical se realiza un aspirado con jeringa y se deposita la parte de medula ósea en un vidrio de reloj para hacer extensiones en los portaobjetos y preparados para realizar posteriormente las tinciones oportunas en el departamento de hematológica sección citoquímica, según el criterio diagnostico.

Una vez realizada la aspiración se adentra más en el hueso, para conseguir una toma del mismo y después de la extracción se introduce en líquido de Bouin y se remite al servicio de anatomía patológica.

Fijación y decalcificación

Se recibe la muestra de medula ósea del departamento de hepatología con su correspondiente  hoja de estudio anatomo-patológico, en la cual viene referenciada con los datos del paciente, material remitido y la sospecha clínica. La muestra que envían viene fijada desde la extracción en liquido de Bouin, este liquido actúa como fijador estructural, por su contenido de ácido pícrico actúa coagulando las proteínas a través de la formación de picratos. El liquido de Bouin  tiene poder de descalcificación, pero hay que evitar que el tejido no este en esta solución mas de 48 horas.

Liquido de Bouin:

            -Solución acuosa saturada de ácido pícrico (Ácido pícrico 2% en agua destilada)       750 ml.

            -Formol 40%   250 ml.

            -Ácido acético glacial  50 ml.

Antes de su procesamiento automático se realizara una prueba por métodos físicos del control del grado de decalcificacion tisular y después un lavado con alcohol de 70º para eliminar los restos amarillentos de ácido pícrico.

Procesamiento, confección de bloque y corte.

El procesamiento se realiza automáticamente (Leica TP 1050) con sistema de vació.

La realización del bloque se realiza en una estación e inclusión, colocando eje mayor de  la muestra  paralela a la superficie de corte, con un ángulo leve de inclinación. Esta comenzara el corte con menos resistencia, reduciendo así la posibilidad de desplazar el tejido fuera del bloque y la vibración e inestabilidad del borde de la cuchilla o del bloque también se minimizan notablemente.

Después de confeccionado el bloque se colocara este, en una placa de frió para su posterior corte por medio de micrótomo de rotación o tipo minot. Se realizaran varios cortes de entre 3 a 5 micras.

El secado de las preparaciones después de  realizar los cortes, se introducirán en una estufa a 60ª C durante 24 horas.

Tinciones de rutina.

Hematoxilina-eosina

Esta técnica advierte del patrón arquitectural del crecimiento, identifica los característicos nucleolos, que definen a las células de Stermberg-red en la enfermedad de Hodgkin y los diversos matices de basofilia citoplasmáticas d los elementos de diferenciación plamocitica.

Soluciones:

-Hematoxilina de Harris (Merck).

-Eosina acuosa 1%.

-Alcohol-clorhídrico 0.5%.

Procedimiento:

1.- Desparafinar e hidratar

2.-Solución hematoxilina de Harris…………………….….5 minutos

3.-Agua corriente.

4.-Diferenciar con solución alcohol-clorhídrico 0.5%..........2 pases

5.-Azulear con agua corriente caliente.

6.-Solución eosina 1%...........................................................1 minuto.

7.-Lavar con agua corriente.

8.-Deshidratar, aclara y montar.

Resultados:

Núcleos……………… .Azul.

Citoplasma…………… Rosado a rojo.

Restantes estructuras ….Rosado a rojo.

Giemsa

Con esta técnica nos permite identificar notablemente los infiltrados de granulocitos eosinofilos y mastocitos por su carácter metacromático.

Soluciones:

-Solución Giemsa comercializada (Azur eosina-azul de metileno según Giemsa-Merck) al 35 % en agua destilada.

-Agua acética al 1%.

 Procedimiento:

1.- Desparafinar e hidratar

2.-Solución Giemsa comercializada…………………………2 horas.

3.- Diferenciar con agua acética 1%.........................................2 pases.

4.- Deshidratar con alcohol absoluto.

5.-Aclara y montar.

Resultados:

Citoplasma………………....….Rosa.

Núcleos……………………......Azul.

Eritrocitos……………………..Rojo.

Gránulos de células cebadas…..Púrpura.

Técnica de PAS

Identifica los elementos en diferenciación hacia células plasmáticas (inclusiones PAS+)

Soluciones:

-Solución acuosa de ácido periódico 0.8%

-Reactivo de Shiff comercializado ( Schiff´s reagent fuchisin-sulfite reagent Sigma-Aldrich.)

-Hematoxilina de Harris.

-Solución Alcohol-clorhídrico 0.5%.

Procedimiento:

1.- Desparafinar e hidratar

2.-Solución acuosa de ácido periódico 0.8%.....................................................5 minutos.

3.-Agua corriente.

4.-Reactivo de Shiff comercializado.................................................................30 minutos.

5.-Lavar con agua caliente.

6.-Hematoxilina de Harris……………………………………………………5 minutos.

7.-Lavar con agua corriente.

8.-Diferenciar con solución alcohol clorhídrico………………………………2 pases.

9.-Lavar con agua corriente caliente.

10.-Deshidratar, aclara y montar.

Resultados:

Núcleos……………….. .Azul.

Material PAS positivo… Rojo oscuro a magenta.

Técnicas de impregnación argéntica de Gordon-sweet para fibras reticulares

Sirve para identificar las perdidas de arquitectura ganglionar que denota infiltración por una neoplasia y para reconocer las zonas de nodularidad, que otorgan los linfomas no Hodgkin.

Soluciones:

-Solución acuosa de permanganato potasico 2%.

-Solución acuosa de ácido oxálico 5%.

-Solución acuosa de alumbre férrico 2%.

-Solución acuosa de cloruro de oro 0.2%.

-solución acuosa de hiposulfito sodico 5%.

-Formol tamponado 10%.

-Solución de plata amoniacal:

            -Solución acuosa de nitrato de plata al 10%...........10 cc.

            -Solución acuosa de hidróxido sodico 10%...............2cc.

            Se mezclan estas dos soluciones y se añade gota a gota amoniaco, hasta disolver        el precipitado.

            -Medir la mezcla y añadir la misma cantidad de agua destilada.

Procedimiento:

1.- Desparafinar e hidratar

2.-Solución acuosa de permanganato potasico.....................................................1 minuto.

3.-Lavar en agua corriente.

4.-Blanquear con solución acuosa de ácido oxálico.

5.-Lavar en agua corriente.

6.-Mordentaje con solución acuosa de alumbre ferrico………………………..….2 minutos.

7.-Lavar en agua corriente

8.-Solución de plata amoniacal……………………………………………...…2 minutos.

9.-Lavar en agua destilada

10.-Reducción con formol tamponado al 10%

11.-Lavar en agua destilada.

12.-Realizar un viraje con la solución acuosa cloruro de oro………………… 2minutos.

13.- Lavar en agua destilada.

14.-Fijar la coloración con la solución acuosa de hiposulfito sodico………….5 minutos.

15.- Lavar en agua destilada.

16.-Deshidratar y montar.

Resultados:

Fibras reticulares………..negras.

Técnica de Azul de Perls

Tiene como utilidad la identificación de hierro ferrico.

Soluciones:

-Solución acuosa de ferrocianuro potasico 20%.

-Solución acuosa de ácido clorhídrico 2%.

-Solución de rojo nuclear extra.

            -Rojo nuclear ………………………………..…..0.2 gr.

            -Solución acuosa de sulfato de aluminio al 5%.....100 cc.

Procedimiento:

1.- Desparafinar e hidratar

2.-Solución acuosa de ferrocianuro potasico y ácido clorhídrico 2% a partes iguales……………………………………..................................................30 minutos.

3.-Lavar con agua corriente.

4..-Solución de rojo nuclear extra.................................................................10 minutos.

5.-Lavar con agua corriente.

6.-Deshidratar, aclara y montar.

Resultados:

Núcleos………………………………….. .Rojo.

Hierro ferrico incluida la hemosiderina ….Azul.

Montaje de las muestra

Por medio automático (Tissue-Tk sca-Sakura) con rollos de film.

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Medula osea en liquido Bouin -

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Control del grado de decalcificación -

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Control del grado de decalcificación -

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Inclusión en caset de plástico -

fiogf49gjkf0dCorte en microtomo tipo Minot">
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Recogida de los cortes en un baño de agua a 45ºC. -

Resultados    

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Técnica Giemsa -

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técnica PAS -

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Técnica Azul de Perls -

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Tecnica de Impregnación Argentica de Gordon-Sweet -

Conclusiones    

Para obtener unos resultados adecuados, debemos seguir una serie de normas y precauciones a lo largo de todo el procesamiento de la biopsia de medula ósea:

1.- Es aconsejable que el cilindro óseo tenga unas dimensiones mininas 2 por 0.2 cm.

2.-Fija la muestra lo más rápido posible, después de ser extraída. Si la muestra no se fija en ese momento se desecara y se producirán artefactos.

3.-El liquido de Bouin es un fijador y decalcificador, pero hay que tener cuidado que no este incluido el tejido en esta solución mas de 48 horas, porque endurece el tejido.

4.-Antes de su procesado automático controlar el grado de decalcificación y lavar con alcohol 70%, para eliminar el pigmento amarillento del ácido pícrico.

5.-La correcta confección del bloque, con el eje mayor de la muestra paralela a la superficie de corte y una leve inclinación, permitirá que la cuchilla ejerza menos resistencia y minimice la vibración e inestabilidad.

6.-Evitar un desbastado rápido al realizar el corte.

7.-El secado de las preparaciones es importante para que el material no se desprenda del portaobjetos al realizar las técnicas de coloración.

8.-Un estudio adecuado de la medula ósea, requiere la realización de técnicas histoquímicas y en algunos casos inmunohistoquimicas y ultraestructurales, que en conjunto nos permiten obtener el diagnostico para establecer el tratamiento, el pronostico y control de la enfermedad.

Bibliografía    

Comentarios

- MARIA DOLORES BLANCO FLORES (01/05/2007 19:10:52)

NOSOTROS TRABAJAMOS CON EL MISMO PRFOCEDIMIENTO PERO NUESTRO TALON DE AQUILES ES LA OBTENCION DE OPTIMOS RESULTADOS EN TECNICAS INMUNOHISTOQUIMICAS.EL MATERIAL TRATADO CON BOUIN Y LA INMUNOHISTOQUIMICA PROVOCAN SOBREXPRESION.

- FRANCISCO BORJA GUTIERREZ CORRES (09/05/2007 12:04:08)

la sobreexpresión puede ser producida por un desenmascaramiento excesivo o por la dilución del cromogeno muchas garcias por leer el trbajo

- Aleida Herrera Batista (18/05/2007 1:08:28)

Muy interesante y útil el trabajo. Gracias por compartirlo y muchas felicidades

- Maria Haydee Aunchayna Mary (27/05/2007 19:04:11)

Muy buen trabajo.Hace unos años trabajaba como técnico en el laboratorio, ahora desempeño cargo médico, pero siempre estoy muy cerca del trabajo técnico y cua colaboro,les voy a comentar lo de la IHQ pues existen problemas similares .
Felicitaciones, saludos Maria Haydee,-Uruguay

- maritza gonzalez fernandez (01/06/2007 16:12:51)

felicidades,, muy bella esa tecnica de gordon-swett lo imprimi, grasias.
maritza, Clinica Central Cira Garcia la Habana Cuba.

- maritza gonzalez fernandez (01/06/2007 16:14:15)

felicidades,, muy bella esa tecnica de gordon-sweet lo imprimi, grasias.
maritza, Clinica Central Cira Garcia la Habana Cuba.

- Mirta Garcia Jardon (02/06/2007 15:00:02)

Mis felicitaciones. El trabajo es muy bueno y las ilustraciones demostrativas como convincentes las fotos. Nosotros fijamos en formol al 10%, dejamos el Bouin para biopsias renales solamente, y no descalcificamos o si acaso hacemos decalcificación rápida y también resultan útiles.

- FRANCISCO BORJA GUTIERREZ CORRES (04/06/2007 10:39:09)

Mirta Garcia Jardon, la medula osea hay que decalcificarla salvo que se corte en un microtomo motorizado especial para huesos. Con lo referente al cilindro renal no es conveniente la fijacion con liquido de Bouin, porque provoca severa distorsión.
A parte de la fijacion y decalcificacion con el liquido de Bouin existen multiples preparados comerciales que se puede obtener muy buenos resultados par la medula osea.

Un saludo.

- Julio Cesar Perez Suarez (03/07/2007 18:13:56)

Ha utilizado la solución comercial de May and Grunwald´s para la Médula Osea?

- Julio Cesar Perez Suarez (03/07/2007 18:17:28)

Ha utilizado la solución comercial de May and Grunwald´s para la Médula Osea?

- FRANCISCO BORJA GUTIERREZ CORRES (04/07/2007 12:09:22)

Solución Giemsa comercializada (Azur eosina-azul de metileno según Giemsa-Merck) al 35 % en agua destilada.