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Alteraciones en el volumen nuclear de los hepatocitos durante el alcoholismo crónico en ratas Wistar adultas machos. Efecto del Polivit.
Mireyi Meriño Martínez[1], Andrés Dovale Borjas[2], María Caridad García Barceló[1]
(1) ICBP "Victoria de Girón"
Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana CUBA (2) ICBP "Victoria de Girón", Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana CUBA
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Resumen
lay:none">fiogf49gjkf0dEn el tratamiento de las hepatopatías alcohólicas se han empleado complejos vitamínicos pero no se ha investigado el posible efecto hepatoprotector de las mismas durante el consumo crónico de etanol. En nuestro país ha sido empleado el suplemento vitamínico Polivit en otras patologías pero no se reporta su uso en el tratamiento durante el consumo crónico de etanol. Se realizó un estudio descriptivo prospectivo donde se analizó el volumen nuclear de los hepatocitos en las diferentes zonas del lobulillo hepático clásico. Para ello se emplearon ratas Wistar adultos machos, que fueron divididas en dos grupos: a uno se le suministró el complejo vitamínico Polivit y al otro no. Realizándose tres cortes: a las ocho, dieciséis y veinticuatro semanas. Para cada uno de los grupos existieron controles (con agua) y experimentales (con etanol al 15 % ad libitum). Después del sacrificio de los animales, siguiendo las normas de laboratorio establecidas, se extrajo el hígado y las muestras tomados se fijaron en formalina neutra al 12%, se incluyeron en parafina y coloreados con hematoxilina y eosina. Se tomaron fotomicrografías con una cámara digital Canon Power Shot A 85 en un microscopio óptico CETI. El estudio morfométrico se realizó con el software ImageTool for Windows v 3.00 y en el análisis estadístico se empleó un ANOVA de una vía con interacción.
Se encontró que el volumen nuclear de los hepatocitos de la zona periportal e intermedia del lobulillo hepático clásico de las ratas alcohólicas disminuyó a las 8 semanas, la disminución fue menor en los que recibieron el suplemento vitamínico, mientras que a las 16 y 24 semanas disminuyó en las tres zonas. En las ratas alcohólicas que recibieron vitaminas el volumen nuclear de los hepatocitos no se modificó a las 16 semanas en la zona intermedia pero se incrementó en las de 16 y 24 semanas en la zona centrolobullillar.
Estos resultados apoyan un posible efecto hepatoprotector del complejo vitamínico Polivit frente a los daños causados por el consumo crónico de etanol.
Referencias bibliográficas principales:
1- Martin Villares C, Dominguez Calvo J, San Roman Carbajo J, Fernandez Pello ME, Pomar Blanco P. Heavy alcohol intake, malnutrition and head and neck cancer patients. Article in Spanish. Nutr Hosp. 2004 Nov-Dec; 19(6): 348-52.
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3- Hígado y alcohol. Disponible en: http://www.alfinal.com/Salud/ higadoyalcohol.shtml Up date: 19/03/04.
4- Jorge E. Corzo, MD Complicaciones médicas del alcoholismo. Disponible en: http://www.detox.es/articulos Up date: 20/03/2004.
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Introduccion
Las toxicomanías constituyen uno de los problemas más graves de la humanidad ya que representan el principal problema de salud en la mayoría de los países. Dentro de las toxicomanías el alcoholismo se destaca como la más trascendente. El alcohol es una de las drogas a la que se tiene más fácil acceso y la que recibe una poderosa propaganda comercial, convirtiéndose en muchos países, en un verdadero problema social, que afecta a ambos sexos y a todas las edades (1 – 4).
El alcoholismo es una enfermedad que no sólo causa incontables trastornos para el paciente en el ámbito social, sino que también lo afecta de forma orgánica, provocándole manifestaciones digestivas, nerviosas, endocrinas, etc. Entre las lesiones que más afecta a los individuos que abusan del consumo de etanol, están las hepatopatías alcohólicas, es decir aquellas que afectan directamente al órgano central del metabolismo y de la destoxificación de esta droga (4 - 8).
Múltiples son las lesiones hepáticas que provoca el consumo de alcohol, resumidas en: esteatosis, hepatitis alcohólica y cirrosis hepática. Estas se presentan a cualquier edad, incluso en la etapa prenatal y afecta en la actualidad prácticamente a ambos sexos por igual (6, 9 – 12).
Desde hace mucho tiempo los complejos vitamínicos están incluidos en el tratamiento del alcoholismo (13), ya que se conoce que las reservas de estos compuestos durante el consumo crónico de etanol están disminuidas, sin embargo, en la literatura no se encuentran trabajos suficientes que sustenten el efecto protector de las vitaminas en las hepatopatías alcohólicas (14). En nuestro país ha sido empleado el suplemento vitamínico Polivit en otras patologías pero no se reporta su uso en el tratamiento durante el consumo crónico de etanol.
La existencia de un número cada vez mayor de pacientes afectados por el alcoholismo, en los cuales es difícil lograr un cambio en su estilo de vida (15), nos hace pensar que sería conveniente la realización de estudios donde además de evaluar los cambios histológicos que se pueden presentar en el hígado durante el consumo crónico de etanol, también se valore la utilización de fármacos del tipo de los complejos vitamínicos, como el Polivit, que pudiera brindarle citoprotección a este órgano y de esta forma evitar la aparición de complicaciones mayores.
Objetivo.
Determinar el comportamiento del volumen nuclear de los hepatocitos durante la ingestión crónica de etanol y el consumo del Polivit.
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Material y Métodos
Se trata de un trabajo básico, experimental sobre la base de un estudio prospectivo descriptivo utilizando las ratas Wistar adultos machos como modelo biológico. Las ratas provinieron del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Realizándose los experimentos en el Bioterio del ICBP “Victoria de Girón”.
Selección de la muestra.
Se emplearon 78 ratas albinas, adultos machos, aparentemente sanas, con una edad entre 10 y 14 semanas y un peso entre 180 y 390g. Con ellas se conformaron dos grupos de 39 animales cada uno, 24 animales de cada grupo fueron escogidos al azar mediante sorteo, a los que se les suministró alcohol etílico al 15 % en el agua de beber, los 15 animales restantes de cada grupo constituyeron los controles. El experimento se realizó durante 8, 16 y 24 semanas conformándose de esta forma tres subgrupos respectivamente. A uno de los grupos se le suministró el suplemento vitamínico Polivit en el agua de beber (CV). Por problemas técnicos la población quedó conformada de la siguiente forma:
Tabla 1: Distribución de las ratas con Polivit según la condición: control – experimentales.
Semanas |
Controles |
Experimentales |
SV |
CV |
SV |
CV |
8 |
5 |
5 |
8 |
8 |
16 |
5 |
5 |
8 |
8 |
24 |
5 |
5 |
8 |
8 |
SV = sin vitaminas CV = con vitaminas
Se emplearon ratas machos por no estar el sexo masculino afectado por los cambios hormonales cíclicos de las hembras y ser mayor la frecuencia relativa de alcoholismo en los hombres (16). Se realizó el primer corte a las 8 semanas, que es el tiempo en el cuál aparecen los cambios que soportan los criterios de cronicidad. El alcohol se administró en el agua de beber por ser ésta la vía fisiológica menos estresante para el animal, que garantiza la ingestión durante todo el tiempo que duró el experimento y ser de uso frecuente en los estudios de alcoholismo crónico (17).
Tratamiento
A las ratas experimentales de cada grupo se les suministró alcohol etílico en el agua de beber a una concentración de 15 g/100 ml (18), durante 8, 16 y 24 semanas lo que permitió una ingestión diaria per cápita promedio de 6g o más por Kg. de peso.
Los controles recibieron agua durante el mismo tiempo. En ambos caso la administración del líquido fue ad libitum bajo las mismas condiciones.
A uno de los grupos se le administró como complemento vitamínico de la dieta de ratonina una tableta de Polivit por cada 500 ml de agua o solución alcohólica. Cada tableta de Polivit contiene:
2, 5 mg de Tiamina clorhidrato (vitamina B - 1)
1, 6 mg de Riboflavina (vitamina B - 2)
20, 0 mg de Nicotinamida
0, 25 mg de Acido Fólico
0, 006 mg de Cianocobalamina (vitamina B - 12)
2, 0 mg de Piridoxina (vitamina B - 6)
2500 UI de vitamina A
Las ratas fueron colocadas en jaulas individuales, se alimentaron con dieta ratonina proveniente del CENPALAB y se mantuvieron en iguales condiciones ambientales e higiénicas según las normas institucionales establecidas para los experimentos con animales.
Procesamiento del material.
Al finalizar cada etapa de tratamiento los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (40 mg/Kg.) por vía intraperitoneal. Se perfundieron inicialmente con suero fisiológico y luego con formol al 12%. Posteriormente se decapitaron y se procedió a extraer el hígado en un tiempo siempre inferior a los 5 minutos. El órgano se lavó en solución salina fisiológica, y se pesó en una balance analítica BLA - 2002 - MT.
Todas las muestras fueron procesadas con la técnica de inclusión en parafina y se le realizaron cortes a 7 mm de grosor con un micrótomo vertical Spencer. La coloración empleada fué la de hematoxilina – eosina (19).
Estudio morfométrico.
Se midió la variable morfométrica volumen nuclear (VN). Para realizar este estudio morfométrico se digitalizaron previamente las imágenes con la combinación de un microscopio CETI con objetivo de inmersión 100 X y ocular de proyección 3 X con una cámara digital Canon Power Shot A85 con aumento total de 11 X. Las mediciones fueron realizadas utilizando el software Imagen Tool v 3.00 (20). Los valores de los diámetros mayores (L) y menores (B) se recogieron en una tabla en Excel calculándose el volumen nuclear con la fórmula de Palkovits V = p/6 L B2 (21).
Para este proceder primeramente se digitalizó la imagen a menor aumento para delimitar tres zonas, trazándose una línea imaginaria desde la vena centrolobulillar hasta la zona portal, a la región que ocupó una posición intermedia se le denominó zona intermedia. Luego se digitalizó las imágenes con un objetivo de inmersión 100 X teniendo en cuenta las tres zonas del lobulillo hepático: zona centrolobulillar, zona intermedia, zona periportal. En cada animal se midieron 40 núcleos o más en cada zona.
Análisis estadístico.
Para el análisis estadístico se tomaron las siguientes variables:
Variable dependiente continua: volumen nuclear de los hepatocitos en cada zona del lobulillo hepático.
Variables independientes: Consumo de etanol y del suplemento vitamínico Polivit.
Los valores fueron almacenados en bases de datos utilizando el programa Microsoft Excel. Mediante el software Systat 7.0. Los resultados de las mediciones se exportaron al paquete estadístico SPSS for Windows v 11.0.1 para su procesamiento.
Se calcularon medias aritméticas y desviaciones estándar a todas las variables bajo estudio. Realizandose un análisis de varianza (ANOVA) para ver el comportamiento de los diferentes grupos ante los factores (alcohol, vitaminas, alcohol * vitaminas y semanas).
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Resultados
Se compararon las medias de los volúmenes nucleares de los hepatocitos de los diferentes grupos en las distintas zonas del lobulillo hepático (tabla 2, 3, 4). Las tres zonas presentaron variaciones entre ellas aunque su comportamiento fue similar en los diferentes grupos por semanas, observándose los siguientes resultados: las medias nucleares disminuyeron desde la zona centrolobulillar hacia la periportal.
A las ocho semanas las ratas experimentales que no consumieron vitaminas presentaron medias en sus volúmenes nucleares superiores a sus controles, mientras que a las 16 y 24 semanas se produjo el fenómeno inverso (tabla 2, 3, 4).
Las ratas experimentales sin vitaminas a las ocho semanas presentaron volúmenes nucleares menores a lo de sus controles. A las 16 y 24 semanas los volúmenes de las experimentales eran mayores que los controles sin vitaminas (tabla 2, 3, 4).
Al realizar un análisis de la varianza de una vía se observa que el factor alcohol y la interacción alcohol * vitaminas no actúa de forma significativa en ninguna de las zonas del lobulillo hepático mientras que las vitaminas y el factor semana si lo hacen de forma significativa en las distintas zonas (tabla 2, 3, 4).
Se realizó un Post Hoc Test (comparación múltiple de Bonferroni) entre los distintos grupos (por semanas) en las diferentes zonas observándose que existe una variación significativa en las medias de los volúmenes nucleares de las tres zonas del lobulillo hepático entre los grupos de las semanas 8 y 16. No existiendo significación entre ambos grupos respecto a los de 24 semanas (tabla 5).
Tabla 2: Estadística descriptiva del volumen nuclear en la zona periportal del lobulillo hepático según los grupos por semanas.
zonas |
semanas |
CSV |
ESV |
CCV |
ECV |
periportal |
8 |
x= 153,46 |
x =158,84 |
x =127,24 |
x= 120,84 |
s = 63,44 |
s = 61,77 |
s =42,59 |
s = 41,68 |
n = 296 |
n = 698 |
n = 498 |
n = 486 |
16 |
x= 139,69 |
x= 126,58 |
x = 94,15 |
x = 112,87 |
s = 40,21 |
s = 35,86 |
s = 34,27 |
s = 39,39 |
n = 249 |
n = 347 |
n = 184 |
n = 368 |
24 |
x= 136,26 |
x= 121,99 |
x= 134,97 |
x = 135,21 |
s = 44,06 |
s = 27,51 |
s = 41,99 |
s = 44,69 |
n = 260 |
n = 359 |
n = 223 |
n = 433 |
x = media s = desviación estándar n = total de núcleos medidos
CSV = controles sin vitaminas CCV = controles con vitaminas
ESV = experimentales sin vitaminas ECV = experimentales con vitaminas
zonas |
|
etanol |
vitaminas |
etanol
+
vitaminas |
semanas |
periportal |
F |
0.102 |
10.099 |
0.485 |
7.19 |
p |
0.750 |
0.002 |
0.488 |
0.002 |
F = Prueba de Fisher p = probabilidad
Tabla 3: Estadística descriptiva del volumen nuclear en la zona intermedia del lobulillo hepático según los grupos por semanas.
zonas |
semanas |
CSV |
ESV |
CCV |
ECV |
intermedia |
8 |
x= 187,30 |
x= 202,78 |
x= 156,90 |
x= 140,09 |
s = 72,91 |
s = 61,73 |
s = 55,93 |
s = 40,30 |
n = 250 |
n = 511 |
n = 506 |
n = 461 |
16 |
x= 158,45 |
x= 145,38 |
x= 122,49 |
x= 125,40 |
s = 46,94 |
s =38,78 |
s = 28,47 |
s = 40,69 |
n = 242 |
n = 338 |
n = 239 |
n = 355 |
24 |
x= 152,22 |
x= 135,78 |
x= 162,98 |
x= 163,90 |
s = 46,46 |
s = 28,05 |
s = 60,38 |
s = 48,03 |
n = 260 |
n = 322 |
n = 244 |
n = 379 |
media x = s = desviación estándar n = total de núcleos medidos
CSV = controles sin vitaminas CCV = controles con vitaminas
ESV = experimentales sin vitaminas ECV = experimentales con vitaminas
zonas |
|
etanol |
vitaminas |
etanol
+
vitaminas |
semanas |
intermedia |
F |
0.248 |
11.691 |
0.546 |
9.42 |
p |
0.621 |
0.001 |
0.463 |
0.000 |
F = Prueba de Fisher p = probabilidad
Tabla 4: Estadística descriptiva del volumen nuclear en la zona centrolobulillar del lobulillo hepático según los grupos por semanas.
zonas |
semanas |
CSV |
ESV |
CCV |
ECV |
centrolobulillar |
8 |
x= 187,37 |
x =221,86 |
x= 154,50 |
x= 153,73 |
s = 68,68 |
s = 82,35 |
s = 59,24 |
s = 63,38 |
n = 327 |
n = 692 |
n = 368 |
n = 397 |
16 |
x= 174,07 |
x= 159,05 |
x= 121,13 |
x= 153,77 |
s = 50,60 |
s = 51,46 |
s = 40,26 |
s = 49,54 |
n = 213 |
n = 329 |
n = 241 |
n = 403 |
24 |
x= 180,71 |
x= 149,27 |
x= 169,29 |
x= 184,32 |
s = 63,15 |
s = 40,10 |
s = 53,45 |
s = 56,65 |
n = 298 |
n = 359 |
n = 239 |
n = 374 |
x = media s = desviación estándar n = total de núcleos medidos
CSV = controles sin vitaminas CCV = controles con vitaminas
ESV = experimentales sin vitaminas ECV = experimentales con vitaminas
zonas |
|
etanol |
vitaminas |
etanol
+
vitaminas |
semanas |
centrolobulillar |
F |
1.228 |
12.360 |
1.583 |
4.57 |
p |
0.272 |
0.001 |
0.213 |
0.014 |
F = Prueba de Fisher p = probabilidad
Tabla 5: Comparación múltiple de Bonferroni entre los distintos grupos por semanas en las tres zonas del lobulillo hepático.
Zona |
Semanas |
|
p |
Periportal |
8 |
16 |
0.02 |
24 |
0.182 |
16 |
8 |
0.02 |
24 |
0.332 |
Intermedia |
8 |
16 |
0.000 |
24 |
0.054 |
16 |
8 |
0.000 |
24 |
0.261 |
Centrolobulillar |
8 |
16 |
0.013 |
24 |
0.475 |
16 |
8 |
0.013 |
24 |
0.407 |
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Discusión
Los resultados encontrados muestran una variación del volumen nuclear en las diferentes zonas del lobulillo hepático, aumentando éste desde la zona periportal hacia la centrolobulillar lo que coincide con lo reportado por numerosos autores que plantean que en el lobulillo hepático la heterogeneidad zonal no solo se establece desde el punto de vista funcional sino también morfológico (22 - 25).
En la literatura no encontramos trabajos donde se analizara el comportamiento del volumen nuclear de los hepatocitos durante el alcoholismo crónico que nos permitiera establecer una comparación con los resultados obtenidos en nuestra investigación.
Cuando analizamos el volumen nuclear de los hepatocitos del total de ratas tratadas con etanol contra los controles no se encuentran diferencias estadísticamente significativas, el menor volumen encontrado en el grupo experimental sin vitaminas puede ser relacionada con el efecto tóxico que ejerce esta droga a nivel pancelular (24).
Se conoce que en el curso de las distintas hepatopatías alcohólicas se produce un déficit vitamínico y que el alcohol y/o los metabolitos derivados de este, no solo son capaces de actuar de forma directa y negativa a nivel nuclear, sino que también afecta a otros elementos relacionados con la síntesis de ADN como es el ácido fólico (26 – 28).
Si analizamos los resultados encontrados en los grupos de ratas alcohólicas que consumieron Polivit y la significación que tuvo el factor vitamina en este experimento, pudiéramos pensar que el suplemento vitamínico suministrado a estas ratas, le proporcionó a las mismas un efecto hepatoprotector, al encontrarse en este grupo valores de volúmenes nucleares superiores a los de sus controles. Como es bien conocido existe una relación directa entre el volumen nuclear y la actividad celular, asociada con un aumento en la síntesis proteica que, a su vez, puede estar relacionada con la síntesis de los complejos enzimáticos involucrados en el metabolismo de las grasas. El menor volumen observado en las ratas experimentales del grupo de ocho semanas puede relacionarse con una menor actividad celular, esto nos sugiere que las vitaminas necesitan un tiempo mayor para que se manifiesten sus efectos, al menos en lo relacionado al volumen nuclear.
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Conclusiones
1. La ingestión crónica de etanol provoca una disminución del volumen nuclear de los hepatocitos indicando una disminución de su actividad.
2. La administración del suplemento vitamínico Polivit aumentó el volumen nuclear de los hepatocitos de la ratas alcohólicas lo que sugiere un efecto hepatoprotector de las vitaminas en el alcoholismo crónico.
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22. Zumeta Dubé, Melvis T. Efectos del ácido fólico sobre el timo y el hígado en la descendencia de ratas adolescentes que consumen etanol durante la gestación. Trabajo para optar por el título de especialista de primer grado en Histología. ISCMH. ICBP “Victoria de Girón”. Cuba; 2005.
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26. Cáceres A, Hernández M, Muñoz J, Rodríguez A. Las vitaminas en la nutrición humana. 1999. Ayuntamiento San bartolomé de Tirajana. 84-930154-4-X.
27. Maurice E. Shils, James A. Olso, Moshe Shike. Modern nutrition in health and disease. 9th ed. 1998.
28. Benjamin T Buston, Willis R. Foster. Human nutrition. McGraw-Hill Book Company. 4th ed. 1998.
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Comentarios
- Rosa María Coro Antich (02/05/2007 15:04:57)
Muy interesante el trabajo. Excelente metodología y análisis.
Solo me quedo con deseos de ver imágenes...
A qué aumento tomaron las imágenes panorámicas?
Aunque no tomo alcohol, seguro que seguiré tomando nuestro Polivit!
Saludos y éxitos,
Rosa María
Dra. CB Rosa María Coro Antich
Instituto de Neurología y Neurocirugía, La Habana
- Irene Rodriguez-Perez (14/05/2007 19:05:23)
Dra.Mireyis Merino y cols. Me alegra mucho ver sus resultados, que conocemos fue tema de su trabajo de Tesis. Es un tema interesante, por darnos una perspectiva posible a seguir experimentando en el uso de las vitaminas como apoyo al mejoramiento de la tan discutida enfermedad, que es el alcoholismo.Le estimulamos a que siga profundizando en el tema. Ha sido ademàs una alegria para mi comunicarme con usted a través de este Congreso. Mis màs carinosos saludos.Espero haya recibido un mail de mi parte en dias pasados. Dra. Irene Rodriguez Pérez
- Liana Yanet Rojas Rodríguez (15/05/2007 19:15:56)
El alcoholismo acompaña al hombre desde épocas tempranas, muchos investigadores a lo largo de la historia han encaminado su trabajo para tratar de disminuir el consumo de este tóxico y con esto los graves problemas que trae aparejado, sin embargo, reportes estadísticos indican que su consumo aumenta y cada vez es menor la edad de comienzo del mismo. Resulta muy importante para todos este trabajo realizado por ustedes, donde utilizan vitaminas con resultados muy interesantes.
Los felicito. Excelente exposición.
- Mirtha Inés Ríos Pérez (20/05/2007 5:04:19)
Felicitaciones Dra.Mireyis Merino y cols. , sin dudas es un tema que nos atrae a todos, por su impotancia y vigencia.....
Nuevamente Felicidades
Cariños
Dra. Mirtha
- Mireyi Meriño Martínez (25/05/2007 16:49:15)
Gracias a todos. Espero que de una forma u otra les fuera de utilidad. Saludos Mireyi
- Maria Laura Haramboure (02/06/2007 19:42:29)
Felicitaciones. Muy interesante
- Juan Pablo Garcia de la Torre (11/06/2007 12:13:45)
Es un trabajo muy completo con un magnífico estudio estadístico. Felicidades. Estaría mas adornado dado el foro en el que estamos si añadieran algunas imágenes histológicas no obstante no resta calidad.
- Andrés Dovale Borjas (12/06/2007 15:26:32)
Gracias Juan Pablo por su comentario. No incluímos fotomicrografías en este trabajo porque lo haría muy extenso y porque pensamos presentar un próximo trabajo con los resultados morfológicos de esta investigación.
Andrés Dovale
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