9º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

Nº 924. Comunicación libre

Direccion de contacto
Javier S. Castresana, Unidad de Biología de Tumores Cerebrales, Universidad de Navarra, Irunlarrea 1, 31008 Pamplona, España, Tel: +34.948.425600 (ext. 6486), Fax: +34.948.425652, Email: jscastresana@unav.es

Ruta de señalización sonic hedgehog en meduloblastoma, glioblastoma y neuroblastoma.

Mehdi Hayat^[1], Javier S. Castresana^[1]
(1) Universidad de Navarra, Pamplona ESPAÑA

Resumen

igado el papel de la ruta de señalización hedgehog en glioblastomas, neuroblastomas y meduloblastomas. Para ello hemos detectado la expresión de los genes PTCH, SMO, GLI1 y GLI3en un total de 25 líneas celulares mediante RT-PCR standard y mediante RT-PCR a tiempo real (qRT-PCR) antes y después de someter las líneas celulares a tratamientos con 5-aza-2’-deoxicitidina y tricostatina A, dos potentes inhibidores de la metilación del DNA. También se incluyeron 25 biopsias de glioblastomas en el estudio de qRT-PCR. Estudiamos el promotor del gen SMO mediante PCR específica para metilación, a tiempo real (qMSP) en un total de 80 tumores (40 glioblastomas y 40 neuroblastomas), y en las 25 líneas celulares. Detectamos metilación del promotor de SMO en más de la mitad de las líneas celulares y los tumores. La expresión de PTCH en las líneas celulares fue menor que en los controles normales, justo lo contrario a GLI1. La expresión de SMO y GLI3 fue alta y se mostró una buena correlación entre ambas en glioblastomas y meduloblastomas, aunque en menor proporción en neuroblastomas. Nuestros resultados muestran que el sistema de señalización hedgehog se presenta no sólo en meduloblastomas, como era ya sabido, sino también en glioblastomas, y en algunos casos de neuroblastomas.

La ruta Sonic Hedgehog regula el desarrollo embrionario de vertebrados e invertebrados y contribuye a la formación de diferentes órganos y tejidos, incluyendo el tubo neural. Shh es una proteína secretada por las células de Purkinje, y es responsable de la polaridad y desarrollo del cerebelo. Se une a células diana que presentan el receptor Ptch, promoviendo la proliferación y el crecimiento celular. La sobreexpresión de Shh lleva a alteraciones del desarrollo y a la formación de tumores, como el medulobastoma, entre otros.
En ausencia de Shh, Ptch inhibe al receptor Smo. La unión Shh-Ptch libera la expresión de Smo, quien activa la expresión de Gli1 y Ptch. El gen GLI1 fue identificado en glioblastoma. GLI1 actúa como activador de la proliferación celular, GLI2 como activador o represor, y GLI3 como represor.
Se ha demostrado recientemente que Smo es necesario para la expresión de GLI3 en carcinoma de colon, y que la metilación de SMO lleva al silenciamiento de la expresión de GLI3, independientemente de Shh.

A fin de estudiar esta hipótesis en tumores cerebrales malignos, hemos seleccionado 25 líneas celulares (6 de meduloblastoma, 8 de glioblastoma y 11 de neuroblastoma) (Tabla 1) y 80 tumores (40 glioblastomas y 40 neuroblastomas) para analizar la expresión de PTCH, GLI1, SMO y GLI3, y la metilación de SMO (Tabla 2). La expresión se estudió mediante RT-PCR estándar y cuantitativa (qRT-PCR) y fue comparada con la expresión de RNA de cerebro adulto como control positivo. Después de tratar las líneas celulares con los agentes demetilantes 5-aza-2’-deoxicitidina y tricostatina A (TSA), se analizó de nuevo la expresión de RNA. También se analizó la expresión de SMO mediante PCR cuantitativa específica para metilación (qMSP) en tumores y líneas celulares.

Tabla 1 - <div style= fiogf49gjkf0dOligonucleótidos usados para RT-PCR standard (s), qRT-PCR (q) o ambas técnicas (s,q). SMO-M y SMO-U se utilizaron como oligonucleótidos de metilación (M) y no metilación (U) para qMSP. Tª: temperatura de anillamiento, bp: pares de bases del producto amplificado.">
Tabla 1 -

Oligonucleótidos usados para RT-PCR standard (s), qRT-PCR (q) o ambas técnicas (s,q). SMO-M y SMO-U se utilizaron como oligonucleótidos de metilación (M) y no metilación (U) para qMSP. Tª: temperatura de anillamiento, bp: pares de bases del producto amplificado.

Tabla 2 - <div style= fiogf49gjkf0dTécnicas aplicadas para explorar PTCH, SMO, GLI1 y GLI3 en cada grupo de líneas celulares y tumores. *: técnicas desarrolladas antes y después del tratamiento con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA. n.d.: no determinado. MB: meduloblastoma, NB: neuroblastoma, GB: glioblastoma. ">
Tabla 2 -

Técnicas aplicadas para explorar PTCH, SMO, GLI1 y GLI3 en cada grupo de líneas celulares y tumores. *: técnicas desarrolladas antes y después del tratamiento con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA. n.d.: no determinado. MB: meduloblastoma, NB: neuroblastoma, GB: glioblastoma.

Expresión de PTCH, GLI1, SMO y GLI3
Las 6 líneas de meduloblastoma, 7 de 8 de las líneas de glioblastoma (excepto U87MG), y 4 de 11 líneas de neuroblastoma (SK-N-MC, MC-IXC, SK-N-DZ and IMR-32) expresaron SMO y GLI3 (Figuras 1 y 2, Tabla 3). El resto de las líneas de neuroblastoma (7 de 11) sólo expresaron SMO. La línea de glioblastoma U87MG sólo expresó GLI3. La mayor parte de las líneas de meduloblastoma, glioblastoma y neuroblastoma mostraron expresión menor de PTCH que en los controles de cerebros de adultos normales (Figura 1). La expresión de PTCH se incrementó tras los tratamientos con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA (Figura 3, Tabla 3). Todas las líneas celulares y 25 glioblastomas expresaron GLI1 en mayor cantidad que los controles normales (Figura 1).

Metilación del promotor de SMO
Cuatro líneas de meduloblastoma (PFSK-1, TE671c2, D283 and SK-PN-DW) presentaron un incremento de SMO tras los tratamientos con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA (Figura 3). Lo mismo ocurrió en la línea de glioblastoma U87MG y en 2 líneas ed neuroblastoma (SK-N-F1 and Be(2)c) ((Figura 3). Las curvas de melting sugieren que el promotor de SMO presenta hemimetilación/metilación parcial (Figura 4). A fin de corroborar estos resultados en tumores, estudiamos 40 glioblastomas y 40 neuroblastomas mediante qMSP y análisis de las curvas de melting (Figura 4). De ellos, 24 glioblastomas (60%) y 16 neuroblastomas (40%) presentaron hemimetilación/metilación parcial del promotor de SMO.

Figura 1 - Expresión de RNA comparativa de PTCH, SMO y GLI1 determinada mediante RT-PCR standard (A-C) y qRT-PCR (D-G). M: meduloblastoma, N: neuroblastoma, G: glioblastoma, L: RNA de pulmón, Br: RNA normal de cerebro adulto, NTC: control sin DNA, Mr: 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).

Figura 1-continuacion - Expresión de RNA comparativa de PTCH, SMO y GLI1 determinada mediante RT-PCR standard (A-C) y qRT-PCR (D-G). M: meduloblastoma, N: neuroblastoma, G: glioblastoma, L: RNA de pulmón, Br: RNA normal de cerebro adulto, NTC: control sin DNA, Mr: 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).

Figura 2 - <div style= fiogf49gjkf0dExpresión de RNA comparativa de SMO y GLI3 determinada mediante RT-PCR standard (A) y qRT-PCR (B-E). M: meduloblastoma, N: neuroblastoma, G: glioblastoma, L: RNA de pulmón, Br: RNA normal de cerebro adulto, NTC: control sin DNA, Mr: 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).">
Figura 2 -

Expresión de RNA comparativa de SMO y GLI3 determinada mediante RT-PCR standard (A) y qRT-PCR (B-E). M: meduloblastoma, N: neuroblastoma, G: glioblastoma, L: RNA de pulmón, Br: RNA normal de cerebro adulto, NTC: control sin DNA, Mr: 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).

Figura 2-continuación - <div style= fiogf49gjkf0dExpresión de RNA comparativa de SMO y GLI3 determinada mediante RT-PCR standard (A) y qRT-PCR (B-E). M: meduloblastoma, N: neuroblastoma, G: glioblastoma, L: RNA de pulmón, Br: RNA normal de cerebro adulto, NTC: control sin DNA, Mr: 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA).">
Figura 2-continuación -

Tabla 3 - Expresión de PTCH, SMO y GLI3 en líneas celulares de meduloblastoma, glioblastoma y neuroblastoma, antes y después de los tratamientos con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA. MB: meduloblastoma, GB: glioblastoma, NB: neuroblastoma. -: no se expresa, +/-: no se presenta un nivel claro de expresión, + a ++++: diferentes niveles de expresión.

Figura 3 - <div style= fiogf49gjkf0dExpresión de RNA comparativa de PTCH (A, D), SMO (B, E) y GLI3 (C, F) antes y después de los tratamientos con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA, determinada mediante RT-PCR standard (A-C) y qRT-PCR (D-F). El gen TFR se incluyó como control de expresión de RNA.">
Figura 3 -

Expresión de RNA comparativa de PTCH (A, D), SMO (B, E) y GLI3 (C, F) antes y después de los tratamientos con 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA, determinada mediante RT-PCR standard (A-C) y qRT-PCR (D-F). El gen TFR se incluyó como control de expresión de RNA.

Figura 4 - <div style= fiogf49gjkf0dEstado de metilación del promotor del gen SMO en líneas celulares (A) y en tumores (B), determinado mediante qRT-PCR. Se muestran las curvas de melting del promotor de SMO no metilado (C), hemimetilado/parcialmente metilado (D), y completamente metilado (E) en tres líneas celulares diferentes. Las curvas de melting corresponden a DNA de sangre como control negativo (color rojo), DNA metilado universal (Chemicon International) como control positivo (color verde), DNA de tumor (color azul), y control sin DNA (color negro). Interpretamos el estado de metilación como hemimetilado/parcialmente metilado cuando la temperatura de melting del caso estudiado es medio o un grado mayor que la temperatura de melting del control normal, mientras que una diferencia mayor de temperaturas correspondería a metilación completa. MB: meduloblastoma, GBM: glioblastoma, NB: neuroblastoma.">
Figura 4 -

Estado de metilación del promotor del gen SMO en líneas celulares (A) y en tumores (B), determinado mediante qRT-PCR. Se muestran las curvas de melting del promotor de SMO no metilado (C), hemimetilado/parcialmente metilado (D), y completamente metilado (E) en tres líneas celulares diferentes. Las curvas de melting corresponden a DNA de sangre como control negativo (color rojo), DNA metilado universal (Chemicon International) como control positivo (color verde), DNA de tumor (color azul), y control sin DNA (color negro). Interpretamos el estado de metilación como hemimetilado/parcialmente metilado cuando la temperatura de melting del caso estudiado es medio o un grado mayor que la temperatura de melting del control normal, mientras que una diferencia mayor de temperaturas correspondería a metilación completa. MB: meduloblastoma, GBM: glioblastoma, NB: neuroblastoma.

Tras el análisis de la expresión de SMO y GLI3 podemos concluir que la expresión de SMO parece ser necesaria para que se dé la expresión de GLI3 en meduloblastoma y glioblastoma, según se muestra con la clara correlación de la expresión de estos dos genes en estos dos tipos de tumores. Podemos pensar que Gli3 actúa como un activador en estos tumores. Sin embargo, en neuroblastoma no podemos sacar esas conclusiones, ya que la correlación entre la expresión de SMO y GLI3 se ve sólo en 4 de las 11 líneas celulares.

También hemos demostrado metilación del promotor de SMO en líneas y tumores y el hecho de que la expresión de SMO aumenta tras los tratamientos de 5-aza-2’-deoxicitidina y TSA en líneas celulares. Sin embargo, parece que la metilación no juega un papel significativo para silenciar el gen, ya que se detecta un buen nivel de expresión de SMO en la mayoría de la líneas celulares.

Finalmente, hemos demostrado que el sistema sonic hedgehog se encuentra activado en glioblastoma y meduloblastoma, pero no siempre en neuroblastoma.

Mehdi Hayat es un becario de la AECI (Agencia Española de Cooperación Internacional), Madrid. Se agradece la colaboración de Paula Lázcoz en este trabajo, tanto a nivel de consejos generales para llevarlo a cabo, como por las extracciones de DNA a partir de los neuroblastomas. Igualmente, Aiala Lorente ha colaborado en la interpretación de las curvas de melting.

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