Nº 843. Comunicación libre
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Morelva C. Toro de Méndez[1], Antonio Llombart Bosch[2] |
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lay:none">fiogf49gjkf0d En 81 biopsias de cáncer de cuello uterino diagnosticados en el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Clínico Universitario de Valencia, España determinamos la presencia de secuencias de ADN de virus papiloma humano (HPV) mediante el método PCR-SPF10 y tipificación por hibridación reversa en tira, LiPA para examinar la distribución de diferentes tipos de HPV en esta neoplasia. De los tumores cervicales incluidos en este estudio, 62 correspondieron a carcinoma epidermoide (76.5%) y En nuestro medio, se confirma la asociación entre el cáncer de cuello uterino y la infección por HPV oncogénico; el HPV16 es el tipo viral más frecuentemente encontrado en dicha asociación. La presencia de ADN HPV de alto riesgo, específicamente los genotipos virales 16 y 18, ratifica que el HPV es el agente causal necesario e inductor del desarrollo del cáncer cervical, tanto de origen epidermoide como glandular. Nuestros resultados demuestran, una vez más, que una tasa mayor al 95% de los carcinomas de cuello uterino posee secuencias de ADN HPV confirmando así su estrecha relación etiopatogénica con la carcinogénesis cervical. El método PCR-SPF10/LiPA es rápido, exacto y sencillo para detectar y genotipificar tipos virales específicos o como co-infección, tanto de bajo como de alto riesgo oncogénico. Palabras clave: cáncer de cuello uterino, detección de ADN-HPV, PCR-SPF10/LiPA.
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Abreviaturas: LIE: lesión intraepitelial escamosa. LIEAG: lesión intraepitelial escamosa de alto grado. HPV: virus papiloma humano. HPVBR: virus papiloam humano de bajo riesgo oncogénico. HPVAR: virus papiloma humano de alto riesgo oncogénico. NIC: neoplasia intraepitelial cervical. Las pruebas moleculares de detección aplicadas en investigaciones epidemiológicas a nivel poblacional han proporcionado de manera consiste suficiente evidencia de que el ADN de ciertos papilomavirus humanos (HPV) está presente en más del 95% de los casos de cáncer cervical, estableciéndose de esta forma la relación causal entre la infección genital por HPV y el cáncer cervical (Walboomers et al, 1999; Bosch y Muñoz, 2002; Bosch et al, 2002; Bosch y de SanJosé, 2003). Entre el 2% y el 20% de la población femenina mundial incuba ADN HPV oncogénico, demostrado mediante la detección del genoma viral en muestras cervicales tisulares y celulares de diferentes grupos clínicos. Además se ha establecido que, bajo ciertas condiciones, estas infecciones virales persisten y son capaces de inducir el desarrollo de lesiones intraepiteliales de alto grado que progresan a cáncer invasor. De esta población, las pacientes cuya edad se encuentra sobre los 30 años podrían representar aquellas en las que ha fallado la eliminación del virus (persistencia viral) y se consideran entonces, el grupo con relativo alto riesgo de cáncer cervical (Monsonego et al, 2004). No obstante, todas estas investigaciones muestran ciertas limitaciones al momento de establecer comparaciones, debido a que incluyen población y métodos de muestreo variables, así como métodos de diagnóstico diferentes y no estandarizados. A pesar de ello, la correlación geográfica entre la prevalencia de la infección por HPV y la incidencia de cáncer de cuello uterino es bastante elevada (Bosch y de Sanjosé, 2003; Muñoz et al, 2003). La persistencia de la infección por HPV depende de la permisividad celular y de cofactores que cooperan con el virus para que este se replique y aumente la carga viral, siendo esto un evento crucial para el desarrollo del cáncer cervical. La mayoría de las infecciones por HPV son transitorias, eliminándose espontáneamente, con intervención adecuada del sistema inmune, pero también puede pasar a un estado de latencia por un largo período de tiempo (Ho et al, 1998; Stubenrauch y Laimins, 1999). Durante la persistencia del HPV en el epitelio cervical es posible que ocurra la integración del genoma viral en el celular, de allí la relevancia de esta fase de persistencia. La habilidad de los HPV para integrarse al genoma celular es la propiedad que le proporciona un potencial oncogénico; el desarrollo de la neoplasia intraepitelial y la enfermedad invasora ocurren como consecuencia de las alteraciones genéticas y epigenéticas inducidas por la expresión continua y persistente de las oncoproteínas de los HPVAR (Southern y Herrington, 2000; Stanley, 2001; Castellsagué et al, 2002; Scheurer et al, 2005; Steenbergen et al, 2005;). Hasta el presente, existen más de 200 tipos de papilomavirus humanos bastante semejantes en su estructura y organización genómica, de los cuales por lo menos 118 tipos se han aislado y secuenciado completamente, mediante la secuencia de ADN de la región L1 del genoma viral, región bien conservada en todos los papilomavirus (revisado en De Villiers et al, 2004; Bernard, 2005). El comité internacional de taxonomía de los virus (International Committe on the Taxonomy of Virus, ICTV) ha reconocido y separado oficialmente a los miembros de la antigua familia Papovaviridae de la ahora familia Papillomaviridae (De Villiers, 2004): En el año 2003, Muñoz y cols reiteraron que el HPV 16 y 18 son los tipos oncogénicos más asociados a cáncer cervical y que además existen papilomavirus con potencial oncogénico que anteriormente se consideraban de riesgo intermedio. Se trata de los tipos virales HPV 26, 53 y 66. Otros HPV con riesgo intermedio encontrados principalmente en lesiones precancerosas que en las de tipo invasor son HPV 35, 39, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 64 y 70. El HPV16 es el tipo viral más frecuentemente encontrado tanto en pacientes citológicamente normales (Ho et al, 1998) como en pacientes con NIC y carcinoma invasor (Muñoz et al, 2003). Esta prevalencia se repite a nivel mundial (Bosch y de Sanjosé, 2003). Considerando la evidente relación entre los papilomavirus oncogénicos y el cáncer cervical se hace necesario incluir la detección de secuencias virales en los programas de pesquisa de cáncer de cuello uterino y sus precursores que, en conjunto con las vacunas anti-HPV, comprenden estrategias precisas de prevención de dicha neoplasia (Meijer et al, 2006). Desde su introducción hasta la actualidad, se está validando el uso y la aplicación en la rutina de laboratorio para la genotipificación de HPV, los cebadores de consenso SPF10 que amplifican un pequeño fragmento (65 pares de base) de la región L1 de los HPV(Kleter et al, 1998, 1999; van Muyden et al, 1999), lo cual le confiere una alta sensibilidad al ensayo ya que discrimina entre un amplio espectro de alrededor de 43 tipos de HPV tanto en biopsias de tejido como en material celular de pacientes con lesiones premalignas y malignas del cuello uterino (Pirog et al, 2000; van Doorn et al, 2002; Beerens et al, 2005; Perrons et al 2002, 2005; Didelot-Rousseau et al, 2006; Hindryckx et al 2006). La sensibilidad y especificidad de los procedimientos de laboratorio basados en PCR podría mostrar un amplio rango de variación que depende principalmente de los cebadores utilizados, del tamaño del producto obtenido, de las condiciones que rigen la reacción, del rendimiento de Es imprescindible evaluar la integridad del ADN genómico en el espécimen y su idoneidad para el análisis molecular a través de la utilización de controles internos adecuados tales como la amplificación del gen beta-globina o cualquier otro gen que nos indique la presencia de material genómico adecuado (Saiki et al, 1985). Los métodos moleculares empleados para la detección y genotipificación del HPV permiten identificar a las pacientes con alto riesgo de desarrollar cáncer cervical invasor, a aquellas con una lesión precancerosa y aquellas con riesgo de progresión. De igual forma, dichos métodos tienen utilidad en la elaboración de vacunas, estudios epidemiológicos y referentes a la historia natural de la infección (Cuschieri y Cubie, 2005). Los resultados del estudio ALTS (The ALTS group, 2003) en pacientes con ATIPIAS / LIE han encontrado que muchas de ellas (especialmente con atipias que no descartan una LIEAG) tienen asociado un tipo de HPVAR y, por lo tanto, se consideran pacientes de alto riesgo a desarrollar una lesión clínicamente significativa (NIC 2 o más) entre un 30% y 40% en comparación con aquellas infectadas por un HPVBR (10%-15%). Por ello, sugieren que en el protocolo de manejo de pacientes con citologías atípicas se incluya el estudio molecular para detección y tipificación viral, como complemento a la evaluación citomorfológica y clínica para un mejor seguimiento. La detección molecular del HPV proporciona un enfoque diferente para la pesquisa de cáncer cervical y el manejo de estas pacientes. Considerando este contexto, se llevó a cabo este estudio para investigar la presencia de secuencias de ADN HPV en casos de cáncer cervical, en nuestro medio, mediante el método PCR-SPF10 y tipificación por hibridación reversa en tira, LiPA y examinar la distribución de diferentes tipos de HPV asociados a esta neoplasia.
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1. Muestra. El material para estudio consistió en la selección de casos de cáncer invasor de cuello uterino diagnosticados en el Servicio Anatomía Patología del Hospital Clínico Universitario de Valencia, España, utilizando los archivos muertos y computarizados de este servicio. Se incluyeron dos grupos, el primero con los casos diagnosticados durante los años 2000 a 2005 y el segundo, con 15 casos de cáncer de cuello uterino diagnosticados entre los años 1969 y 1998, por encontrarse este material archivado y disponible. Estas muestras de tejido fueron fijadas con formalina tamponada al 10% e incluidas en parafina. Una vez obtenido el listado de casos de cáncer cervical se procedió a ubicar los bloques de parafina con el tejido neoplásico incluido, así como las correspondientes hematoxilinas originales que, en su momento, sirvieron para emitir el diagnóstico definitivo. Las hematoxilinas originales de todos y cada uno de los casos de cáncer cervical se revaluaron con la finalidad de corroborar el diagnóstico original y para clasificar los casos de acuerdo al tejido epitelial que le dio origen, considerando los siguientes criterios histopatológicos establecidos en Blaustein, 1994. Fueron excluidos todos aquellos tumores que presentaron algunas de las siguientes características: excesiva necrosis y hemorragia, material tumoral insuficiente, material tumoral mal preservado y aquellos casos en los que no encontramos los bloques de parafina correspondientes.
2. Detección y genotipificación del ADN-HPV.
2.1 Obtención previa de secciones de bloques de parafina para la extracción de ADN-HPV.
Este protocolo fue cedido por el grupo de trabajo que desarrolla el proyecto Retrospective International Survey of Human Papillomavirus Types in Cervical Cancer (RIS HPVTT), Instituto Catalán de Oncología, Barcelona-España.
Para cada muestra preparamos el siguiente material: un bloque de parafina sin tejido incluido (bloque en blanco) por caso, que se cortó antes de cada muestra; dos tubos Eppendorf de 1.5 ml rotulados con el código designado y una cuchilla sin usar por caso. Se siguieron estrictamente cada una de las siguientes recomendaciones: usamos guantes y los cambiamos regularmente. Limpiamos el microtomo antes y después de cortar los bloques con desinfectante, luego con xilol y finalmente con etanol. Usamos una cuchilla nueva para cortar cada bloque y su correspondiente bloque de parafina en blanco (sin tejido). Se realizaron 5 cortes de 5 μm de espesor cada uno, por duplicado y se colocaron en tubos Eppendorf de 1,5 ml previamente rotulados. Retiramos el bloque, limpiamos como se indicó anteriormente, cambiamos la cuchilla, cortamos el bloque de parafina en blanco correspondiente, luego el siguiente bloque de tumor y así sucesivamente para todos los casos restantes.
2.2 Aislamiento de ADN celular (Davis et al, 1994). Los 5 cortes fueron sometidos a desparafinización con xilol y se lavaron con etanol absoluto. Se resuspendió el pellet en 500 μl de solución de lisis (SDS 0.5%, Tris HCl 10mM pH8, NaCl 0.15M, EDTA 5mM). Se añadió a cada tubo, 25 μl de proteinasa K (0.5 mg/ml) y se incubó durante toda la noche a 55ºC. Para la extracción del ADN se añadió 500 μl de fenol equilibrado con Tris-HCl ph 8,5. Luego se añadió un volumen igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y se dejó actuar durante 1 hora. Se recogió la fase acuosa y se añadió un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico durante 30 minutos. Se precipitó el ADN con 0.1 volumenes de AcNa 3M pH5.2 y 2 volumenes de etanol absoluto frío durante toda la noche a -20ºC. Se lavó el precipitado (pellet) con etanol 70% frío y luego se secó el pellet en estufa a 37ºC durante 10 minutos y se resuspendió con agua bidestilada con la cantidad adecuada según el tamaño del pellet (5-30μl). El ADN resuspendido se almacenó a 4ºC hasta su amplificación con PCR.
2.3 Amplificación del ADN-VPH por PCR. Se realizó una prueba de PCR previa para estimar la calidad del ADN extraído amplificando el gen interferon, INF (cebadores INF150DR: CTGGGATGCTCTTCGACCTC /INT150DF: TCTTTTCTTTCCCGATAGGT). Las muestras con una banda nítida en la electroforesis para INF fueron sometidas a amplificación de un segmento de 65 pb de la región L1 del ADN-HPV utilizando el set de cebadores SPF10 . La reacción se realizó a un volumen total de 50 μl. La mezcla de la reacción contenía 2 mM de MgCl2, Triton X-100 al 0.1%, 200μM de cada dNTPs, 10 μl de la mezcla de cebadores SPF10 biotilinados, 1.5 UI de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (Perkin-Elmer) y 10 μl de ADN aislado. Las condiciones de la PCR en el termociclador fueron las siguientes: desnaturalización inicial y activación de la polimerasa a 94ºC 9', 40 ciclos en los que se repite la desnaturalización a 94ºC 30", cebado a 52ºC 45" y elongación a 72º 45" con una extensión final a 72ºC 5'. Se incluyeron controles positivos de VPH 6 (Innogenetics, Bélgica) y controles negativos que sólo contenían mezcla de reacción. La visualización del producto de la PCR-SPF10 se llevó a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa al 3%, teñido con bromuro de etidio y empleando una corriente de 125 mv. Si la muestra analizada contenía ADN de VPH, la banda esperada tenía aproximadamente 65 pb.
2.4 Hibridación reversa en tira (LiPA) para la genotipificación del ADN-HPV amplificado. Las muestras que resultaron ADN-HPV positivas por PCR-SPF10 fueron sometidas a genotipificación del tipo de HPV asociado mediante el método de hibridación reversa en tira (INNO-LiPA, Innogenetics Inc.), según Kleter y cols, 1998, 1999. En este ensayo, el producto de PCR-SPF10 se mezcló con una solución desnaturalizante y se puso en contacto con la tira de nitrocelulosa que contiene líneas paralelas inmobilizadas de oligonucléotidos, para la identificación de 25 tipos de HPV diferentes (HPV 6, 11,16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 56, 58, 59, 66, 68, 70 y 74), de manera simultánea en un único ensayo; seguidamente se incubaron las tiras a 49ºC. Las tiras fueron entonces incubadas con el conjugado de estreptavidina marcado con fosfatasa alcalina diluido en solución de conjugado 1:100, con agitación sobre placa rotatoria a 20ºC durante 30 minutos, luego se realizaron lavados con solución de enjugue y con buffer sustrato y se añadió el sustrato diluido 1:100 en solución del sustrato e incubamos 30 minutos en agitación mientras se desarrollaba la reacción de color. La hibridación y la reacción de color quedo demostrada por la presencia de un color púrpura sobre la línea(s) de hibridación. Los resultados de esta hibridación fueron evaluados visualmente mediante la comparación con una plantilla patrón.Todos los casos con infección múltiple fueron sometidos a una segunda tipificación por el mismo método a fin de corroborar los casos o definir aquellos en los cuales las bandas no estaban del todo claras.
Análisis estadístico. Los datos fueron almacenados en una base de datos de Access para Microsof Office. Para el estudio estadístico empleamos variables binarias, reflejando la presencia/ausencia de una determinada característica histopatológica o categórica en función de la naturaleza de las variables analizadas. Con la finalidad de simplificar el análisis. La asociación entre las diferentes variables se determinó utilizando el test de la Chi-cuadrado para determinar la homogenidad o la tendencia lineal de la asociación en el caso de las variables ordinales. En las tablas 2x2, se calcula el estadístico exacto de Fisher cuando una tabla que no sea resultado de columnas o filas perdidas de una tabla mayor presente una casilla con una frecuencia esperada menor que 5. Para todas las restantes tablas 2x2 se calcula el Chi-cuadrado corregido de Yates.
En el caso de variables ordinales, aplicamos el coeficiente de correlación de Pearson, r, que es una medida de la asociación lineal entre dos variables, y el coeficiente de correlación de Spearman, que es una medida de la asociación entre los órdenes de los rangos. Los valores de ambos varían entre -1 (relación negativa perfecta) y +1 (relación positiva perfecta). Un valor de 0 indica que no existe relación lineal alguna. Todos los tests empleados están incluidos en el paquete estadístico SPSS (versión 12.0). Se estableció el nivel de significación estadística a partir del 5% (p=0.05). En todos los test se han tomado como límites de significación p=0.05, considerándose: no significativo p>0.05; significativo p=0.05; muy significativo p<0.01 y altamente significativo p<0.005.
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1. Clinico-patológicos. La edad de la paciente para cada caso de cáncer de cuello uterino se obtuvo a partir del informe histopatológico realizado originalmente en este servicio, dato que se recopiló en 58 casos. El rango de edad de las pacientes fue de Si consideramos la edad de las pacientes de acuerdo al tipo histológico de cáncer cervical, encontramos la siguiente distribución sin diferencias importantes (p=0.778): la edad de las pacientes con carcinoma epidermoide osciló entre los 36 y 55 años (agrupando las dos proporciones de casos más altas); en cambio, con los adenocarcinomas cervicales, la mayor proporción de casos se encontraba en dos grupos de pacientes diferentes, un grupo cuya edad estaba entre los 36 y 45 años y otro correspondiente a las mayores de 65 años. La mitad de las pacientes (7/14) con adenocarcinoma cervical eran mujeres jóvenes en edad reproductiva. Los casos de cáncer de cuello uterino se clasificaron y obtuvimos la siguiente distribución: 62 tumores cervicales se encuentran en la categoría diagnóstica de carcinoma epidermoide (76.5%) y 19 en el tipo histológico de adenocarcinoma (23.5%). Si consideramos los diferentes grados de diferenciación tumoral en los carcinomas epidermoides obtenemos la siguiente distribución: en la población de carcinoma epidermoide de cuello uterino de este estudio predomina el grupo de tumores moderadamente diferenciados (MD) (43.5%), seguido de los bien diferenciados (BD) (21%). El grupo de los carcinomas con menos diferenciación quedó conformado por 22.6% de los inmaduros (I) más el 12.9% de los inmaduros e indiferenciados (II).
Por otra parte, considerando los subtipos histológicos en los casos de adenocarcinoma cervical obtuvimos que la mayor proporción de adenocarcinomas pertenece al tipo endocervical (42.1%), seguido de los adenocarcinomas endometrioides (26.3%); los tipos villoglandular y papilar alcanzaron porcentajes el 15.8% y 10.5%, respectivamente; el 5.3% restante representa a un tipo mucinoso. 2. Detección y genotipificación del ADN-HPV. De los 81 tumores de cuello uterino, en 3(3.7%) no se logró amplificar el gen INF por lo que fueron excluidos del proceso de genotipificación; a los 78(96.3%) casos restantes, se le realizó PCR-SPF10 logrando amplificarse las secuencias de ADN-HPV presentes en estas muestras y, por lo tanto, considerándose HPV positivas; de estos, 67(85.9%) casos mostraron infección única y 11(14.1%) infección por 2 ó mas tipos de HPV o infección múltiple. El tipo viral específico más frecuente fue el HPV16 en 45(71.4%) casos seguido de los tipos HPV18 13(19.4%), HPV45 3(4.5%), HPV58 2(3%) y los tipos virales HPV31, HPV66, HPV68 y HPVX en igual proporción, 1(1.5%). Tanto los carcinomas epidermoides como los adenocarcinomas presentaron predominantemente secuencias por un solo tipo viral, 83,1% y 94,7%, respectivamente, sin diferencias estadísticamente significativas (p=0.208). El HPV16 fue el tipo viral más frecuente tanto en carcinomas epidermoides 35(71.4%) como en los adenocarcinomas cervicales 10(55.6%); el HPV18 se detecto en el 44,4% de los adenocarcinomas cervicales y en el 10,2% de los carcinomas epidermoides (p=0.248). Tabla Nº 1. Resumen de los hallazgos relacionados con la detección y genotipificación de ADN-HPV en la serie de cáncer de cuello uterino de este estudio. Casos de cáncer cervical ADN-HPV positivos:
Frecuencia de los tipos específicos de HPV (infección única), n=63/78:
Distribución de la infección única y múltiple de acuerdo al tipo histológico n=78:
p=0.208 Frecuencia de los tipos específicos de HPV en los tipos histológicos.
p=0.248 En la figura Nº 1 se muestra un ejemplo de los resultados obtenidos en una de las tandas de genotipificación de ADN HPV en esta serie de casos de cáncer de cuello uterino (A) y varias tiras-LiPA seleccionadas y amplificadas para visualizar la ubicación de la hibridación con infección por HPV, única y múltiple (B).
Al realizar la interpretación de las tiras LiPA utilizadas para la genotipificación de los papilomavirus humanos presentes en los casos de cáncer de cuello uterino, consideramos positivo todo vestigio de coloración, claramente visible, sobre las diferentes líneas (oligonucléotidos) en la tira y observamos los siguientes detalles: 1. la línea de marcaje para el conjugado fue efectivamente positiva en todos los casos. 2. la línea correspondiente al control 1 de HPV siempre fue menos intensa (rosa pálido) que la línea del control 2 de HPV, cuya intensidad varió entre negro y gris oscuro. 3. cuando la línea de control 2 de HPV era de color negro (púrpura muy intenso), las líneas correspondientes al o los HPV presentes en las muestras también eran muy oscuras. 4. cuando la línea de control 2 de HPV era clara, también las líneas de los genotipos virales presentes en las muestras eran bastante claras e inclusive podían variar de tonalidad si estaban presentes a la vez varios tipos virales (infección múltiple). Al revisar la electroforesis de los productos amplificados con el cebador SPF10 de estos casos, se encontró que la banda también era más clara. Este hallazgo podría estar relacionado con la cantidad de secuencia viral presente en las muestras (carga viral). 5. los casos con infección múltiple que involucran los genotipos virales HPV 16/18/45 (figura Nº 2) son un ejemplo de la variedad de tonos de la coloración en las tiras hibridadas que, igualmente, podrían estar relacionados con la carga viral de los diferentes genotipos en cada muestra. Así tenemos, que en las tiras 4 y 18 la intensidad de color fue igual para los tres genotipos hallados. Por el contrario, en la tira 6, la línea que identifica al HPV45 fue más intensa que la línea correspondiente al HPV16 y esta, a su vez, más intensa que la línea del HPV18. En cambio, en la tira 14, la línea más intensa fue para el HPV18 y en menor intensidad encontramos los tipos HPV16 seguido del HPV45. Por lo tanto, en presencia de una infección múltiple, la tira LiPA reflejó si un tipo viral predominaba (línea oscura con líneas más claras), si los tipos virales estaban en la misma “proporción” (las líneas mostraban más o menos la misma intensidad de color) o si un tipo predominaba y los otros estaban en la misma “proporción” entre ellos. 6. En casos de infección única, como por ejemplo la presentada en la figura Nº 1B tira 17 pudimos observar claramente el tipo viral presente en las diferentes muestras (en la electroforesis de los productos de Las combinaciones de HPV conformando las infecciones múltiples se muestran en la tabla Nº 2. Destaca la co-infección HPV16/18/45 que se encuentra en 12/32 casos, seguido de 4 casos con la combinación HPV 16/18 y 2 casos con HPV 16/18/45/66; el resto de los casos mostraron variedad en la combinación de distinto tipos virales, tanto de bajo riesgo como de alto riesgo. En dicha tabla, además notamos lo siguiente:
Tabla Nº 2. Distribución de las combinaciones de genotipos de HPV (infección múltiple) hallados en los casos de cáncer de cuello uterino de este estudio.
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Un total de 78 carcinomas cervicales (96.3%) de este estudio reveló la presencia de ADN HPV. Este hallazgo coincide con la aseveración de que es posible detectar secuencias genéticas de este virus en el rango del 95-100% de la neoplasia cervical invasora cuando se utilizan métodos sensibles y estandarizados (Bosch y de Sanjosé, 2003). En este estudio utilizamos el método PCR-SPF10/LiPA para amplificar un segmento de 65 pb del genoma viral y para la posterior genotipificación. Aunque este método se continúa validando en estudios que además utilizan primers tradicionales como MY09/11 (Garcia-Cabezas et al, 2005) e inclusive en comparación con la captura de híbridos (Perrons et al, 2005), tanto en raspados cervicales (van Doorn et al, 2002; Beerens et al, 2005) como en biopsias de cuello uterino (Kleter et al, 1999; Pirog et al, 2000; Perrons et al, 2002), ha demostrado tener un elevada sensibilidad para detectar la presencia de ADN HPV, habilidad que hemos podido constatar sobre todo por el hecho de que hemos utilizado material archivado incluido en parafina. La eficacia de los métodos moleculares para la amplificación y detección de ADN HPV, específicamente la técnica de PCR, está en función del tamaño del segmento de ADN viral que se amplifique. Así pues, mientras más pequeño es el fragmento genómico es más factible detectar bajas concentraciones de secuencias virales, en particular, a partir de tejido incluido en parafina, el cual se caracteriza porque frecuentemente el ADN puede sufrir daños que conllevan a la degeneración o fragmentación del mismo (Karlsen et al, 1994), haciendo más difícil la detección de ADN viral integrado. La utilización de primers como el sistema SPF10 ofrece la ventaja de detectar ADN viral, aunque este se encuentre en pocas cantidades (carga viral baja), integrado al ADN celular o se detecte a partir de muestra antiguas, mejorando de esta forma el diagnóstico molecular y epidemiológico de los papilomavirus humanos. En relación a los tipos virales más frecuentes, en este estudio de los 78 carcinomas cervicales positivos para ADN HPV, el 85,9% presentó infección por un tipo específico de HPV, fundamentalmente de alto riesgo oncogénico. Muñoz et al 2003 informaron que el 91.9% de los carcinomas cervicales incluidos en su estudio se encontraban infectados por un solo tipo de HPV. Esta investigación incluyó a miles de mujeres de diferentes partes del mundo y en el diagnóstico molecular, aunque fue realizado siguiendo un mismo protocolo, no se usaron los mismos primers para la detección de ADN viral en todas las muestras cervicales. Es posible que la metodología empleada en nuestro estudio permitió la detección de tipos virales en co-infección a diferencia de los utilizados en el estudio anteriormente citado y por ello encontramos un número inferior de casos con infección única. El genotipo viral específico con mayor prevalencia encontrado en este estudio fue el HPV16 (71,4%), el cual, además, no sólo se detectó como tipo específico sino también en co-infección con otros tipos virales. Este hallazgo es mayor que el reportado por Muñoz et al 2003, quienes encontraron una prevalencia de este virus igual a 58.9%, así como también al porcentaje hallado por Bosch et al 1995 (51%) y por Walboomers et al 1999 (49.9%), estudios en los que se utilizaron los primers generales MY09/11 y GP5+/6+ además de primers específicos. Kleter et al, 1999 y Perrons et al 2002, quienes al igual que nosotros utilizaron el sistema PCR-SPF10/LiPA para la detección y genotipificación de HPV, también encontraron una mayor prevalencia de HPV16 en sus respectivos estudios. Así mismo, Beltensen et al 2006 encontraron que 72% de sus muestras neoplásicas, que incluían casos muy antiguos (sobre todo los diagnosticados entre 1931 y 1934), presentaban HPV16, porcentaje muy semejante al nuestro. En cuanto al HPV18, que es el segundo tipo de papilomavirus humano más frecuentemente encontrado en tumores cervicales (Clifford et al, 2003; Muñoz et al, 2003) se aisló de 8 casos de adenocarcinoma cervical (44,4%). La gran mayoría de la literatura considera al HPV18 como el tipo viral más asociado al desarrollo de adenocarcinoma cervical, en un rango que oscila entre el 37-41% (Clifford y cols en el 2003), nuestros resultados se encuentran sobre este rango. Sin embargo, en este estudio existían casos con lesiones glandulares asociadas a una de origen escamoso, en cuyo caso intervendrían otros tipos de HPV y, entre ellos, muy probablemente el tipo 16 que produce grandes cantidades de copias en estado episomal, haciéndolo más prevalente. Esta hipótesis pareciera no sostenerse si se consideran los hallazgos de Chew et al en el 2005; estos autores, luego de evaluar una cohorte de 55 pacientes con adenocarcinoma, a través de la técnica de microdisección laser para separar el tejido glandular neoplásico del resto de tejido epitelial y estromal evitando así la contaminación con displasia adyacente, encontraron que el HPV16 fue el tipo con mayor prevalencia en el adenocarcinoma de cuello uterino, lo cual coincide con nuestros resultados. En este estudio, la mayor asociación entre HPV y adenocarcinoma cervical la ocupa el HPV16 de una forma semejante a la informada por Castellsagué et al, 2006. Posiblemente el HPV 16 y 18 tienden a existir en co-infección, estando uno de ellos en una carga viral menor que el otro, la cual no ha sido detectada mediante el uso de otros primers generales, y que en este estudio posiblemente pudo determinarse gracias a la elevada sensibilidad del sistema de SPF10. Pirog et al 2000, explica que el epitelio glandular no favorece la infección productiva del HPV16 como ocurre en el epitelio escamoso debido a su naturaleza estratificada. Así, el HPV16 permanece en un número de copias bajo en las lesiones glandulares invasoras y prevalece el HPV18, razón por la cual quizás este último es detectado más frecuentemente en la neoplasia glandular. Nuestro resultado (55,6%) entonces coincide con los hallazgos de Pirog et al (2000) y Castellsagué et al (2006) quienes encontraron una mayor prevalencia de HPV16 (50% y 42.7%, respectivamente) en adenocarcinoma cervical seguido del HPV18. Pirog et al (2000) utilizaron SPF10 en 105 adenocarcinomas primarios y en el caso de Castellsagué et al (2006), en una recopilación de 8 estudios de casos-controles llevados a cabo en 3 continentes en que evaluaron 167 adenocarcinomas, usaron el sistema de primers generales GP5+/6+. Es importante destacar que en la serie de casos de cáncer cervical de este estudio, el HPV18 tiene quizás una prevalencia real mayor, cuando se considera en coinfección, que la comunicada cuando se presenta como tipo específico o único, ya que como detallamos más adelante, el HPV18 es uno de los tipos virales fijos en varios casos de cáncer cervical con infección múltiple asociada. En este estudio, hemos encontrado una baja prevalencia de HPVX (1,5%) en comparación con los datos de Muñoz et al 2003, cuyo porcentaje de HPV desconocido fue de 6.4%. Posiblemente el uso del sistema SPF10 permitió identificar un mayor número de tipos de HPV que en otros estudios, quizás debido a que se encontraban en un número mínimo de copias o a que el ADN viral estaba bastante degradado haciendo difícil su detección por medio del uso de otros primers generales. En relación al HPV58, considerado de alto riesgo oncogénico, es importante resaltar su presencia tanto en infección única como formando parte de las co-infecciones virales, sobre todo porque en países con elevadas tasas de cáncer de cuello uterino, como Brasil, existen estudios donde inclusive este tipo viral muestra variantes asociadas a lesión neoplásica (Marreco Cerqueira et al, 2003) o en la población femenina China, donde el HPV58 también es bastante frecuente junto al tipo 52 (Huang et al, 1997). Entre los tipos de HPVAR con mayor frecuencia en el estudio de casos y controles realizado por Muñoz et al, 2003, precisamente el HPV58 fue hallado entre los más frecuentes tanto en las pacientes como en los controles. La infección por múltiples tipos de HPV es un hallazgo común en pacientes con neoplasia cervical intraepitelial (Kleter et al, 1999; Beerens et al, 2005). En este estudio, el 14,1% de los carcinomas de cuello uterino presentó infección múltiple. El rango de prevalencia de la infección múltiple por HPV en cuello uterino es bastante amplio, pudiendo encontrarse entre el 0% (van Muyden et al, 1999) hasta más del 50% (Levi et al, 2002). Esta amplia variación podría estar influenciada por varios factores, entre los que no podemos dejar de mencionar a las características epidemiológicas de los grupos clínicos así como la metodología utilizada para la detección del ADN viral. Las pacientes jóvenes con lesiones precancerosas tienden a ser el grupo con mayor prevalencia de infecciones múltiples (Sasagawa et al, 2001; Perrons et al, 2002; Cuschieri et al, 2004; Clifford et al 2005). De igual forma, una elevada prevalencia de múltiples tipos de HPV se obtiene en estudios en los que se incluyen pacientes HIV positivas, alcanzando cifras de hasta 78% (Levi et al, 2002). Es posible que la verdadera prevalencia de las infecciones múltiples haya sido subestimada, principalmente en estudios epidemiológicos, debido al uso de metodologías moleculares con baja sensibilidad para detectar ciertos tipos de HPV. Esta hipótesis, que compartimos, fue planteada por Muñoz et al 2003 y por Trottier y Franco, 2006. La co-infección de varios tipos virales formando entre sí variadas combinaciones fue un hallazgo sorprendente en este estudio. Llama la atención la marcada presencia del HPV45, que es relevante por ser un tipo oncogénico, a pesar de que no se encontró en ningún caso como infección única. También es importante recalcar que la co-infección entre el HPV 16 y 18 se hace bastante evidente, con lo cual la prevalencia real de estos virus en esta serie de cáncer cervical es mayor que la estimada cuando se presentan como un tipo específico. Según Trottier et al 2006, múltiples tipos virales podrían actuar de forma sinérgica durante el proceso de carcinogénesis cervical, por lo que el papel que pudiera adjudicársele a las infecciones por múltiples tipos de HPV durante la carcinogénesis cervical aún está por definirse. Finalmente, no podemos descartar la posibilidad de sobrestimar la prevalencia de la infección múltiple, sobre todo cuando usamos métodos de amplificación tan sensibles como
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Al Dr. José Antonio López Guerrero del Instituto Valenciano de Oncología (IVO) y a Estela Pons del Departamento de Patología de
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Beerens E, Van Renterghem L, Praet M, Sturtewagen Y, Weyers S, Temmerman M, Depypere H, Claeys P, Cuvelier CA. Human papillomavirus DNA detection in women with primary abnormal cytology of the cervix: prevalence and distribution of HPV genotypes. Cytopathology, 2005, 16:199-205. Beltensen BI, Kugarajh K, Skar R, Laerum OD. HPV subtypes in cervical cancer biopsies between 1930 and 2004: detection using general primer pair PCR and sequencing. Virchows Arch., 2006, 449:141-147. Bernard H-U. The clinical importance of the nomenclature, evolution and taxonomy of human papillomaviruses. J Clin Virol., 2005, 32S:1-6. Bosch FX, de Sanjose S. Human papillomavirus and cervical cancer-burden and assessment of causality. J Natl Cancer Inst Monograf., 2003, 31:3-13. Bosch FX, Lorincz A, Muñoz N, Meijer CJLM, Shah KV. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer. J Clin Pathol., 2002, 55:244-265. Bosch FX, Muñoz N. The etiology of cervical cancer. 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- ELSIE BEATRIZ PICOTT RANGEL (30/04/2007 19:24:16)
- Tatyana Omaña (14/05/2007 0:15:18)
- JULIO CESAR LESCANO SORIANO (15/05/2007 22:19:09)
- JULIO CESAR LESCANO SORIANO (15/05/2007 22:19:11)
- Juan antonio Suarez Gonzalez (25/05/2007 12:26:43)
- RAYMUNDO CASTILLO MEDINA (11/06/2007 23:36:52)
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fiogf49gjkf0dA. Genotipificación de ADN-HPV en las muestras de cáncer de cuello uterino evaluadas mediante el método de hibridación reversa en tira (LiPA). B. Amplificación de una selección de tiras para visualizar la ubicación de la hibridación del ADN-HPV: tira 9 HPV16/18/35/45, tira 14 HPV16/18/45/58, tira 16 HPV31/33/44, tira 17 HPV16, tira 20 HPV16/18/31/45, tira 5 HPV16/18, tira 6 HPV X, tira 9* HPV18.
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