9º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

Nº 791. Comunicación libre

Direccion de contacto
Javier S. Castresana, Unidad de Biología de Tumores Cerebrales, Universidad de Navarra, Irunlarrea 1, 31008 Pamplona, España, Tel: +34.948.425600 (ext. 6486), Fax: +34.948.425652, Email: jscastresana@unav.es

Estudio de subpoblaciones con características de células madre tumorales en Neuroblastoma

Paula Schiapparelli^[1], Mónica Enguita^[1], Jana Balbuena^[1], Paula Lázcoz^[2], Javier S. Castresana^[1]
(1) Universidad de Navarra, Pamplona ESPAÑA
(2) Universidad Pública de Navarra, Pamplona ESPAÑA

Resumen

ue distintas subpoblaciones celulares cuyas propiedades de autorrenovación y proliferación se asemejan a las de las células madre podrian estar implicadas el origen, mantenimiento y biología de las tumores sólidos y hematológicos. Un candidato para estudiar dicha teoría es el neuroblastoma, un tumor embrionario derivado de la cresta neural. En el presente trabajo se planteó analizar la presencia de células madre tumorales en diferentes líneas celulares de neuroblastoma (Nb). Para lo cual se estudió la expresión de marcadores relacionados con éstas por RT-PCR y mediante análisis citométrico por FACS según la técnica del Hoechst 33342. Se observó que las líneas celulares expresaban los genes Melk-1, Bmi-1, Vimentina, c-Kit. El análisis por FACS sugirió la presencia de células primitivas relacionadas con células madre tumorales en todas las líneas, en proporciones variables.

La hipótesis de las “tumor stem cells” (células madre tumorales) se ha planteado dentro del modelo jerárquico del cáncer, y se postula que sólo una pequeña población de células tienen la capacidad significativa de proliferar, mantener y generar nuevos tumores (1). Estas células estarían caracterizadas por su capacidad de autorrenovación (expansión del pool de células madre) y de generación células progenitoras con diferente grado de diferenciación que constituirían la mayor parte del tumor (2). Es interesante considerar que las terapias antitumorales actuales podrían estar siendo dirigidas únicamente a la población de células tumorales no-stem que constituyen la masa principal del tumor, con lo cual la subpoblación stem tumoral no afectada podría estar provocando una recidiva o una resistencia a las terapias antitumorales. De esta manera el estudio, aislamiento y comprensión de la biología de las células madre tumorales podría ayudar a construir terapias dirigidas y más eficaces. En el presente trabajo se analizan 12 líneas celulares de neuroblastoma, un tumor embrionario derivado de las células de la cresta neural, que migran a la medula adrenal y al sistema nervioso simpático. Son los tumores malignos sólidos extracraneales mas frecuentes en los dos primeros años de vida. En este estudio se pretende determinar la presencia de células madre tumorales según dos estrategias.

La primera es estudiar expresión de genes relacionados con células madre y que se expresan en tumores, mediante RT-PCR. Los genes analizados fueron los siguientes: Melk (maternal embryonic leucine zipper kinase) este es un gen que se expresa en células progenitoras durante el desarrollo del cerebro adulto, es un marcador de células progenitoras multipotentes; Bmi-1 un gen requerido para el mantenimiento de células madre adultas en algunos tejidos; Vimentina, es una proteína de la familia de proteínas del filamento intermedio, implicada en la construcción del citoesqueleto que se expresa durante estadios tempranos del desarrollo en distintos tipos celulares entre ellos los astrocitos; cKit, es un protooncogén que codifica una proteína tirosin-kinasa de tipo III receptora transmembrana que tiene un rol importante en procesos de diferenciación, proliferación y apoptosis cuyo ligando es el FCS (stem cell factor) expresado por células con características de pluripotencialidad (3). Además del estudio de expresión se eligieron tres genes para el estudio de metilación a nivel del promotor, puesto que algunos de los genes analizados por RT-PCR poseen islas CpG en el promotor (Vimentina, CD44 y cKit). El CD44 codifica una molécula de adhesión celular implicada en interacciones célula-célula, relacionada con migración y metástasis.

La segunda estrategia es analizar las células por citometría de flujo utilizando FACS (fluorescence activated cell sorting) mediante la técnica descripta por Goodell (4), que se basa en la utilización del fluorocromo Hoechst 33342 el cual se introduce en las células y se une al DNA. Las células madre poseen la capacidad de eluir fuera el fluorocromo gracias a la presencia de unos transportadores de membrana especiales, llamados ABC (ATP-binding-cassette)(4) que se expresan en alto nivel. De este modo al analizar una muestra, se puede encontrar una subpoblación de células llamadas SP (side population) que muestra baja fluorescencia para el Hoechst (Ho Low) en el cuadrante inferior izquierdo de un análisis por FACS (5). En el análisis de las células SP se pueden utilizar diversos inhibidores de los receptores ABC, con el objeto de confirmar los resultados. En el presente trabajo se utiliza el Verapamil, un fármaco que bloquea canales de calcio. Hay evidencias de que la población SP (a diferencia de las No SP) está enriquecida en células madre, células inmaduras y primitivas. Este tipo de células ha sido identificado en diversos tipos de tumores como cáncer de mama, pulmón, líneas celulares de glioblastoma y neuroblastoma (6).

Líneas Celulares:
Las líneas celulares de neuroblastoma analizadas fueron: SHSY5Y, SKNMC, SKNF1, SKNDZ, IMR-32, MCIXC, SKNSH, Be 2C, SKNBe2C, KELLY, SIMA y MHHNB11. Se cultivaron en DMEM +glutamax, 10%FBS, 5% aminoácidos no esenciales, 1% penicilina/estreptomicina, 0,1% anfotericina, a 37º en atmósfera enriquecida con 5% CO2.

Extracción de RNA y retrotranscripción:
Se extrajo el RNA de 5 millones de células, con el Quick Prep Total RNA Extraction Kit (27-9271-01 Amersham Bioscience). El RNA se retrotranscribió a cDNA mediante el uso del SuperScript II ReverseTranscriptase Kit (Cat. 18064-022), utilizando random primers.

RT-PCR:
Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo con los siguientes cebadores:
Melk-1: f-5´cacctcacggctacctatcttc 3´; r-5´tcacttgcggtcacatcttcc 3´
Vimentina: f-5´acattgagattgccacctacag3´; r-5´accgtcttaatcagaagtgtcc3´
C-Kit: f-5´gcagaagccaccaacacc3´; r-5´gagaggacagcggaccag3´
Los fragmentos de PCR se resolvieron en geles de agarosa al 2% y fueron visualizados en un densitómetro.

Metilación de promotores a tiempo real:
Se hizo un tratamiento con bisulfito sódico al DNA genómico de las líneas celulares, para hacer un estudio de metilación a nivel de promotor de los siguientes genes:
Vimentina : f-5´tgagggattttttatttttttt 3´; r-5´tctaaactaaactcaccctaaa 3´
C-Kit : f-5´gaaaatttgggtttttagagta3´; r-5´ccctccaaacctattaaaaact3´
CD44: f-5´ggattttagtttttgttaggtt3´; r-5´caccaaaacttatccataatat3´

FACS y marcaje con Hoescht 33342: análisis de células sp/no sp:
El análisis de citometría de flujo de las líneas celulares se realizó mediante FACSaria (fluorescence activated cell sorting). Las condiciones de marcaje fueron las siguientes: las células tripsinizadas se resuspendieron en FACS buffer (PBS 1X, 5% FBS; 5mM EDTA). Un millón de cel/ml se incubaron con 2,5 ug/ml de Hoescht 33342 a 37ºC durante 2 h. Simultáneamente se procesó un millón de cel/ml de igual manera añadiendo 50 umol/L de verapamil.
Terminada la incubación se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min a 4ºC, se hizo un lavado con buffer y se marcaron con ioduro de propidio 2 ug/ml para descartar las células muertas del análisis.
El fluorocromo se excita a 350 nm y su emisión se mide a dos longitudes de onda: Ho blue: 450/40. Ho red: 576/26.

Metilación a tiempo real (Figura 1):
C-KIT: Obtuvimos 4 líneas claramente metiladas: MCIXC; SKNMC; IMR-32; SHSY5Y. Una de las líneas (SIMA) no da resultados claros, parece estar metilada.
VIMENTINA: todas las líneas no metiladas.
CD44: todas las líneas no metiladas.

RT-PCR (Figura 2):
La expresión de los genes estudiada por RT-PCR se recogen en la tabla 1.
Todas las lineas celulares expresaban Vimentina, Melk-1 y Bmi-1. Para c-Kit se detectaron 6 lineas celulares en que su expresión fue indetectable o menos intensa.

Análisis con FACS Hoechst 33342 (Figura 3):
Según as graficas Ho red/ Ho blue obtenidas mediante el FACS se obtuvieron los los porcentajes de células SP recogidos en la tabla 2.
Los porcentajes obtenidos van desde 0,8% a 11,5%.

Figura 1 - <div style= fiogf49gjkf0dCurvas de metilación para cKit. A) curvas de metilación de los controles. Verde: control metilado (IMD); Rojo: control no metilado (sangre). B) curvas de metilación mostrando los controles y dos líneas celulares. Azul: Be2 C (muestra no metilada) Marrón: IMR-32 (muestra metilada). ">
Figura 1 -

Curvas de metilación para cKit. A) curvas de metilación de los controles. Verde: control metilado (IMD); Rojo: control no metilado (sangre). B) curvas de metilación mostrando los controles y dos líneas celulares. Azul: Be2 C (muestra no metilada) Marrón: IMR-32 (muestra metilada).

Figura 2 - <div style= fiogf49gjkf0dRT-PCR Vimentina. Gel de agarosa al 2%. 1: sangre, 2: control positivo (cerebro), 3: agua, 4:KELLY, 5:SIMA, 6:SKNF1, 7:IMR-32, 8:SHSY5Y, 9:SKNBE2C, 10:SKNDZ, 11:MCIXC, 12:BE2C, 13:SKNSH, 14:MHHNB11, 15:SKNMC, 16: marcador de peso molecular 1Kb. ">
Figura 2 -

RT-PCR Vimentina. Gel de agarosa al 2%. 1: sangre, 2: control positivo (cerebro), 3: agua, 4:KELLY, 5:SIMA, 6:SKNF1, 7:IMR-32, 8:SHSY5Y, 9:SKNBE2C, 10:SKNDZ, 11:MCIXC, 12:BE2C, 13:SKNSH, 14:MHHNB11, 15:SKNMC, 16: marcador de peso molecular 1Kb.

Tabla 1 - <div style= fiogf49gjkf0dRT-PCR. +: Expresión; -: no expresión; +/-: expresión tenue. ">
Tabla 1 -

RT-PCR. +: Expresión; -: no expresión; +/-: expresión tenue.

Figura 3 - Análisis por FACS de la línea celular SHSY5Y. a) células marcadas con Hoechst 33342. b) células marcadas con Hoechst y tratadas con Verapamil. c) y d) intensidad de fluorescencia de los marcajes a y b respectivamente.

Tabla 2 - <div style= fiogf49gjkf0dAnálisis por FACS. % SP: porcentaje de células SP marcadas con Hoechst, %SP verapamil: porcentaje de células SP marcadas con Hoechst y tratadas con Verapamil. ">
Tabla 2 -

Análisis por FACS. % SP: porcentaje de células SP marcadas con Hoechst, %SP verapamil: porcentaje de células SP marcadas con Hoechst y tratadas con Verapamil.

Del análisis de expresión génica se desprende que todas las líneas celulares podrían tener células primitivas relacionadas con células madre tumorales. En el caso de la expresión de c-Kit vemos que hay diferencias entre las líneas, lo que podría deberse al hecho de que tenemos células con distinto grado de diferenciación.

Tras el análisis de metilación de promotores, al no estar metiladas ninguna de las líneas para los genes Vimentina y CD44, podríamos pensar que la desmetilación/no metilación de los promotores seria la responsable de la alta expresión de los mismos. Respecto del c-kit se encontraron 4 líneas metiladas. Esto puede ser debido a que la regulación de su expresión podría ser más compleja, y por la heterogeneidad celular dentro de la linea.

Por último el estudio de las células por FACS según la técnica del Hoechst hemos obtenido supoblaciones SP en todas las líneas celulares en diversos porcentajes que se asemejan a valores obtenidos en diversas investigaciones. La confirmación del fenotipo de estas células con el verapamil no fue concluyente, ya que en varias líneas celulares el porcentaje de células SP se mantuvo prácticamente igual (debería haber disminuido), esto puede deberse a que dicho fármaco inhibe los receptores de tipo ABCB1, y las líneas celulares podrían estar expresando otros subtipos de receptores de la familia. De hecho, diversos autores han descrito que el receptor ABCG2 sería el expresado específicamente en cerebro, con lo cual se debería hacer el estudio utilizando fármacos que inhiban ambos tipos de receptores y profundizar en el estudio especifico del nivel de expresión de éstos en cada línea celular concreta.

Agradecemos la ayuda técnica prestada por parte de Izaskun Gabari, con el equipo FACSAria (BD Bioscience), de la Unidad de Citometría, Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona.

1. Angelo L. Vescovi, Rossella Galli, Brent A. Reynolds. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer 2006, 6:425-36.

2. Clarke MF, Dick JE, Dircks PB, Eaves CJ, Jamieson CH, Jones DL, Visbader J, Weissman IL, Whal GM. Cancer Stem Cells--Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Research 2006, 66:9339-44.

3. Sharma S, Gurudutta GU, Satija NK, Pati S, Afrin F, Gupta P, Verma YK, Singh VK, Tripathi RP. Stem cell c-KIT and HOXB4 genes: critical roles and mechanisms in self-renewal, proliferation, and differentiation. Stem Cells Development 2006, 15:755-78.

4. Goodell MA, Rosenzweing M, Kim H, et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nature Medicine 1997, 3:1337-45.

5. Hadnagy A, Gaboury L, Beaulieu R, Balicki D. SP analysis may be used to identify cancer stem cell populations. Experimental Cell Reseach 2006, 312:3701-10.

6. Hirschmann-Jax C, Foster AE, Wulf GG, Nuchtern JG, Jax TW, Gobel U, Goodell MA. A distinct “side population” of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101:14228-33.