9º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

Nº 789. Comunicación libre

Direccion de contacto
Javier S. Castresana, Unidad de Biología de Tumores Cerebrales, Universidad de Navarra, Irunlarrea 1, 31008 Pamplona, España, Tel: +34.948.425600 (ext. 6486), Fax: +34.948.425652, Email: jscastresana@unav.es

EXPRESIÓN DE CD133 EN LÍNEAS CELULARES DE MEDULOBLASTOMA Y SU RELACIÓN CON OTROS MARCADORES DE CÉLULAS MADRE

Mónica Enguita^[1], Jana Balbuena^[1], Paula Schiapparelli^[1], Paula Lazcoz^[2], Javier S. Castresana^[1]
(1) Universidad de Navarra, Pamplona ESPAÑA
(2) Universidad Publica de Navarra, Pamplona ESPAÑA

Resumen

lay:none">fiogf49gjkf0d INTRODUCCIÓN: Para estudiar la población de células madre en líneas celulares de meduloblastoma, además del marcador CD133 existen otras técnicas, como el análisis de marcadores de inmadurez o la técnica de exclusión del Hoechst que pone de manifiesto la denominada “Side population” (SP). OBJETIVO: Estudiar la posible relación entre la cantidad de células CD133 + dentro de una línea celular con la expresión y metilación de genes asociados a células madre y con la existencia o no de población SP. MATERIAL Y MÉTODOS: El estudio se realizó en 6 líneas celulares de meduloblastoma (PFSK-1, DAOY, TE671, TE671 Sub.2, SK-PN-DW y D283Med). Se estudió el porcentaje de células CD133+ dentro de cada línea, la expresión de varios genes asociados a células madre y cáncer (MELK-1, Vimentina, BMI-1, CD44 y c-Kit) y la metilación de los promotores de algunos de esos genes. Además, se estudio la existencia de una población con alta capacidad de exclusión del Hoechst en cada una de las líneas (Side Population). RESULTADOS: La expresión de los genes asociados a células madre estudiados y el porcentaje de la población SP son independientes del porcentaje de células CD133+ dentro de una misma línea celular. DISCUSIÓN: La subpoblación de células CD133+ y la subpoblación SP han sido dos de los procedimientos más utilizados para el estudio de células madre tumorales. Ambos han demostrado por separado ser muy buenas técnicas de identificación y aislamiento de células madre. Sin embargo, no parece existir relación directa entre ambas poblaciones según los datos obtenidos del análisis de las 6 líneas de meduloblastoma.

Los tumores malignos del sistema nervioso central son los más difíciles de eliminar con las terapias antitumorales actuales. Se cree que el bajo índice de curación es debido a la alta heterogeneidad celular que poseen estos tumores (10). Diversos estudios realizados en varios tipos de tumores, no sólo del SNC, han demostrado ya la existencia de una subpoblacion de células que posee características de células madre normales, como son la capacidad de autorenovación y de diferenciación a varios tipos celulares. A esta subpoblacion se le conoce como células madre tumorales y parece ser la responsable de la formación y mantenimiento de estos tumores (1,2,7).

En el meduloblastoma, tumor neuroectodérmico primitivo que representa un 20% de los tumores cerebrales infantiles (4), se ha aislado una subpoblacion de células, con fenotipo CD133+, que además de presentar las características de autorenovación y diferenciación (11), es capaz de generar un tumor histológicamente similar al de partida, al inyectar 100 de estas células en ratones SCID/NOD, mientras que la inyección de hasta un millón de las células CD133- no producía tumor alguno (12).

Existen, además de la proteína CD133, otras alternativas para aislar subpoblaciones celulares dentro de tumores y líneas. Entre ellas esta la tinción con Hoechst, un colorante que se incorpora en el citoplasma celular. Sólo una pequeña subpoblacion tiene la capacidad de excluir el Hoechst eficazmente y que además ha mostrado en diversos estudios estar enriquecida en estas células madre tumorales (5). A esta subpoblacion se la denomina “side population” (6).

Las investigaciones se centran ahora en encontrar las diferencias existentes entre los distintos tipos de células; tumorales, madre tumorales y madre normales. Por el momento no se han encontrado diferencias significativas en la expresión de oncogenes y genes supresores de tumores, por lo que se sospecha que tales diferencias puedan existir a nivel epigenético (13).

1. Líneas Celulares:
Las líneas celulares de meduloblastoma analizadas fueron: PFSK-1, DAOY, TE671, TE671 Sub.2, SK-PN-DW y D283Med. Se cultivaron en RPMI +glutamax, 10%FBS, 4% aminoácidos no escenciales, 1% penicilina/estreptomicina, 0,1% anfotericina, a 37ºC en atmósfera enriquecida con 5% CO2.

2. Análisis del fenotipo celular CD133+ mediante citometría:
Para detectar el porcentaje de células CD133+ se marcó 1 millón de células de cada línea con un anticuerpo específico (Human AC133-PE, Cat. 120-000-425, Miltenyi Biotec). Como control negativo se usó un isotipo (PE labaled Mouse IgG1 Cat. 559320 BD Biosciences Pharmingen), para descartar uniones inespecíficas. Las células se analizaron por citometría.

3. Análisis de expresión mediante RT-PCR:
Se estudió el efecto de la expresión de CD133 sobre la expresión de otros genes también asociados a células madre y cáncer como: MELK que se sobreexpresa en células tumorales y en células madre embrionarias; c-Kit que es un protooncogén que codifica un receptor de membrana conocido como factor de células madre (3,14); BMI-1 que interviene en la regulación de la autorenovación de células madre neuronales así como de células madre tumorales (8,9); CD44, que interviene en la metástasis tumoral (15) y Vimentina que está involucrada en la respuesta inmune antitumoral.

3.1 Extracción de RNA y Retrotranscripción:
Se extrajo el RNA de 5 millones de células, con el Quick Prep Total RNA Extraction Kit (27-9271-01 Amersham Bioscience). El RNA se retrotranscribió a cDNA mediante el uso del SuperScript II ReverseTranscriptase Kit (Cat. 18064-022).

3.2 Diseño de cebadores:
Se utilizó el programa Primer3 para el diseño de los cebadores utilizando como molde las secuencias de mRNA. Una vez diseñados se comprobó para cada pareja de primers, su especificidad (mediante un programa de alineamiento de secuencias) y que cada primer estuviera en un exón distinto y así poder detectar la contaminación por gDNA. (Tabla 1).

3.3 RT-PCR:
Las reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo en un termociclador y las condiciones de Tª se pusieron a punto para cada gen.

Análisis de la metilación de promotores mediante PCR a tiempo real:
Para estudiar la posible repercusión de mecanismos epigenéticos sobre la expresión de los genes c-Kit, CD44 y Vimentina, se analizó la metilación de los promotores de dichos genes en todas las líneas celulares.
Para ello se hizo un tratamiento con bisulfito sódico al DNA genómico de las líneas celulares, que se utilizó como molde para la PCR. El diseño de cebadores se hizo mediante el programa MethPrimer (Tabla 1).

Exclusión del Hoescht 33342: Análisis de células SP/no SP por FACS
El análisis de citometría de flujo de las líneas celulares se realizó mediante FACSaria (fluorescence activated cell sorting). Las condiciones de marcaje fueron las siguientes: Las células tripsinizadas se resuspendieron en FACS buffer (PBS 1X, 5% FBS; 5mM EDTA). Un millón de cel/ml se incubaron con 2,5 ug/ml de Hoescht 33342 a 37ºC durante 2 h. Terminada la incubación se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min a 4ºC, se hizo un lavado con buffer y se marcaron con ioduro de propidio 2 ug/ml para descartar las células muertas. El Hoescht se excita a una longitud de onda de 350 nm y la fluorescencia emitida se mide a dos longitudes de onda: Ho blue: 450/40. Ho red: 576/26.

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Tabla 1 -

Cebadores utilizados para el análisis de expresión (arriba) y metilación (abajo).

Análisis del fenotipo celular CD133+ mediante citometría:
Los porcentajes de células CD133+ en cada una de las líneas estudiadas fueron: PFSK (0,28%), Daoy (1,83%), TE671 (69,22%), TE671 Sub.2 (37,09%) SK-PN-DW (0,19%) y D283Med (83,98%).

Análisis de expresión mediante RT-PCR:
BMI-1, MELK y VIM se expresan en todas las líneas celulares estudiadas con la misma intensidad si las comparamos con sus respectivos controles. También CD44 aunque en la línea celular SK-PN-DW lo hace de manera mas leve (la doble banda se debe a la coamplificación de una segunda isoforma de CD44).
C-KIT se expresa en las líneas PFSK (levemente), SK-PN-DW y D283Med, pero no en Daoy, TE671 y TE671 Sub.2. (Figura 1).

Análisis de la metilación de promotores:
El promotor del gen vimentina no está metilado en ninguna de las líneas celulares analizadas. El promotor del gen CD44 tampoco está metilado en ninguna de las líneas celulares a excepción de PFSK cuyo resultado puede tener varias interpretaciones. El promotor del gen c-kit está metilado en las líneas PFSK, TE671 y TE671 Sub.2 y no está metilado en la línea Daoy. Los resultados obtenidos para las líneas SK-PN-DW y D283Med tienen varias interpretaciones (Figura 2).

Análisis con FACS Hoechst 33342 :
Según las graficas Ho red/ Ho blue obtenidas mediante el FACS se obtuvieron los siguientes porcentajes de células SP en las líneas celulares:
PKSK (1,7%), Daoy (1,3%), T1 (0,2%), T2 (0,4%), SK-PN-DW (6,5%) y D283Med (4,6%).

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Figura 1 -

Análisis de expresión. De izquierda a derecha: M es el marcador de peso molecular, C+ es cDNA de cerebro adulto, C- es agua y la sangre se utilizó para comprobar la posible contaminación por DNA genómico.

Figura 2 - <div style= fiogf49gjkf0dArriba a la izquierda se muestra el análisis de metilación del gen CD44 en la línea celular PFSK (línea azul oscuro) arriba a la derecha, c-Kit para la línea celular SK-PN-DW (línea color morado). La línea roja es la sangre (control de DNA no metilado), la línea verde es el IMD (DNA metilado artificialemente) y la línea azul claro es agua. Abajo una tabla resumen de todos los resultados de metilación. Metilado (SI), no metilado (NO) y dudoso (?).">
Figura 2 -

Arriba a la izquierda se muestra el análisis de metilación del gen CD44 en la línea celular PFSK (línea azul oscuro) arriba a la derecha, c-Kit para la línea celular SK-PN-DW (línea color morado). La línea roja es la sangre (control de DNA no metilado), la línea verde es el IMD (DNA metilado artificialemente) y la línea azul claro es agua. Abajo una tabla resumen de todos los resultados de metilación. Metilado (SI), no metilado (NO) y dudoso (?).

Análisis del fenotipo celular CD133+ mediante citometría:
La existencia de líneas celulares con un porcentaje tan alto de células CD133+ como es el caso de D283Med y TE671, podría indicar o bien que es una línea celular formada en su mayoría por células muy indiferenciadas, o bien, que no es el marcador más específico para aislar células madre tumorales. Quizá existe otro marcador más específico de esa población de células madre tumorales y que se expresa únicamente en las células CD133+.

Análisis de expresión mediante RT-PCR:
Todas las líneas expresan los genes asociados a células madre y a tumores (BMI-1, Vimentina y MELK-1).
CD44 se expresa en todas las líneas pero de distinta forma, más levemente en PFSK y SK-PN-DW que en el resto, coincidiendo con las líneas que presentan menor contenido de células CD133+. De momento no se puede establecer una relación directa entre ambos marcadores.
c-Kit se expresa preferentemente en las líneas D283Med y SK-PN-DW, ambas son células que crecen en suspensión.

Análisis de la metilación de promotores:
Normalmente, los resultados de los análisis de metilación son bastante exactos y concuerdan con los análisis de expresión, como en el caso de la vimentina, donde todas las líneas expresan el gen no metilado. Sin embargo, a veces se obtienen gráficas sujetas a varias interpretaciones. Por ejemplo, la línea celular Daoy no expresa el gen c-kit a pesar de no tener metilado el promotor de dicho gen, lo que significa que existen otros mecanismos involucrados en el silenciamiento de ese gen. Las gráficas obtenidas tras analizar la metilación de c-kit en las líneas SK-PN-DW y D283Med fueron similares (Figura 2). El pico de desnaturalización del producto amplificado se produce entre la sangre y el IMD. La interpretación más lógica sería que la isla CpG analizada está metilada parcialmente y esa metilación no es suficiente para reprimir la expresión del gen (Figura 1). Por último, la gráfica de metilación del gen CD44 en la línea PFSK es distinta a todas las restantes (Figura 2). Se han mostrado las tres repeticiones para que se pueda apreciar cómo el pico de desnaturalización del producto amplificado a veces coincide con el IMD y a veces con la sangre. La interpretación más lógica en este caso es que uno de los alelos de ese gen está metilado y el otro no. La expresión del gen se produciría gracias al alelo no metilado. Todas estas interpretaciones están pendientes de confirmar mediante secuenciación.

Análisis con FACS Hoechst 33342 :
La subpoblacion celular con alta capacidad de exclusión del Hoechst no solo existe en células aisladas de tumores sino también en líneas celulares como se ha demostrado en este experimento. En ambos casos, los porcentajes suelen ser siempre pequeños. En líneas celulares, esto lleva a la pregunta de ¿cómo puede una población tan reducida sobrevivir a pases y pases sin desaparecer? Probablemente, existe algún mecanismo, diferenciación/desdiferenciación, expresión/represión de determinados genes, que hace que se mantenga constante en el tiempo una población con esas características.

Agradecemos la ayuda técnica prestada por parte de Izaskun Gabari, con el equipo FACSAria (BD Bioscience), de la Unidad de Citometría, Centro de Investigación Médica Aplicada, Pamplona.

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