Direccion de contacto Javier S. Castresana,
Unidad de Biología de Tumores Cerebrales,
Universidad de Navarra,
Irunlarrea 1,
31008 Pamplona, España,
Tel: +34.948.425600 (ext. 6486),
Fax: +34.948.425652,
Email: jscastresana@unav.es
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Estudio de hipermetilación, expresión y deleción homocigótica a nivel del gen p14/ARF en neuroblastoma
Idoia Blanco[1], Paula Lázcoz[1], Ignacio J. Encío[1], Javier S. Castresana[2]
(1) Universidad Pública de Navarra, Pamplona ESPAÑA (2) Universidad de Navarra, Pamplona ESPAÑA
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Resumen
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fiogf49gjkf0d El neuroblastoma es el tumor maligno extracraneal más frecuente en la edad pediátrica. El presente estudio analiza distintas alteraciones genéticas que pudieran darse en el gen p14/ARF de la ruta bioquímica de regulación p53/MDM2/p14ARF del ciclo celular. p14ARF interviene en la activación de p53, el gen más comúnmente mutado en cáncer humano. Dichas variaciones: metilación, expresión y deleción homocigótica se examinaron en 12 líneas celulares de neuroblastoma. No se observó deleción homocigótica ni hipermetilación a nivel del promotor de dicho gen en ninguna de las líneas celulares estudiadas. Asimismo, ninguna de ellas mostró pérdida de expresión. Estos resultados parecen indicar que las alteraciones de este gen no estarían implicadas en la génesis y progresión del neuroblastoma.
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Introduccion
El neuroblastoma es el tumor maligno pediátrico extracraneal más frecuente. A pesar de los tratamientos intensivos, sólo el 25% al 40% de los niños mayores de un año de edad que sufren neuroblastoma como enfermedad diseminada pueden curarse. Inicialmente, la mayoría de los neuroblastomas responden a la terapia citotóxica y la radioterapia regional. Sin embargo, varios casos presentan recidivas con diferentes niveles de resistencia a quimioterápicos. El locus INK4a/ARF, en el cromosoma 9p21-22, codifica dos proteínas estructuralmente diferentes, p16/INK4a y p14/ARF. La primera se comporta como una inhibidora de las kinasas dependientes de ciclinas. p14ARF puede activar la ruta de p53 mediante interacción con MDM2 e inhibición de su actividad ubiquitina, impidiendo la poliubiquitinización, el transporte al núcleo y la degradación citoplásmica de p53. La inactivación de p14ARF mediante deleción o metilación puede incrementar los niveles de MDM2, que, finalmente inactivarán a p53. Hay también evidencia de que p53 regula negativamente la expresión de p14ARF, estableciéndose un circuito de regulación entre p53-MDM2-p14/ARF.
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Material y Métodos
Material. El estudio se llevó a cabo en 12 líneas celulares de neuroblastoma: Kelly, SIMA, MC-IXC, MHH-NB-11, IMR-32, SH-SY5Y, SK-N-MC, SK-N-DZ, SK-N-FI, BE(2)C, SK-N-BE(2), SK-N-SH.
Métodos. 1. El grado de hipermetilación a nivel del promotor de p14/ARF, se determinó mediante MSP (PCR específica para metilación), y PCR a tiempo real, realizando en ambos casos tratamiento de los DNAs con bisulfito sódico. 2. El estudio de la expresión génica se llevó a cabo por RT-PCR semicuantitativa. 3. La presencia de deleción homocigótica se estudió mediante PCR diferencial.
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Resultados
No se observó deleción homocigótica ni hipermetilación de p14/ARF en ninguna de las líneas celulares de neuroblastoma analizadas (figuras 1, 2 y 3). Asimismo, todas las líneas celulares mostraron expresión de dicho gen (figura 4).
Figura 1 - Detección de hipermetilación a nivel del promotor del gen p14 mediante MSP, en líneas celulares de neuroblastoma.
Geles de agarosa al 2,5% teñidos con bromuro de etidio (0,1 μg/ml). m: marcador de peso molecular (1Kb Plus Ladder, Invitrogen). S101: DNA de sangre periférica (control negativo). IMD: DNA metilado “in vitro” (control positivo). U: no metilado (unmethylated). M: metilado (methylated).
Figura 2 - Detección de hipermetilación a nivel del promotor del gen p14 mediante PCR a tiempo real, en líneas celulares de neuroblastoma.
S101: DNA de sangre periférica (control negativo), en rojo. IMD: DNA metilado “in vitro” (control positivo), en verde. SIMA (triplicado), en azul.
Figura 3 - Deleción homocigótica de p14/ARF en líneas celulares de neuroblatoma.
Gel de acrilamida (19:1) al 15% teñido con bromuro de etidio (0,2 μg/ml). Se utilizaron cuatro DNAs extraidos de sangre periférica de donantes sanos como control negativo. El marcador de peso molecular empleado (M) fue 1Kb Plus Ladder, Invitrogen.
fiogf49gjkf0dExpresión génica de p14/ARF en líneas celulares de neuroblastoma.
Geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio (0,1 μg/ml). Se utilizó cDNA humano normal de pulmón como control positivo. M: marcador de peso molecular (1Kb Plus Ladder, Invitrogen). Se amplificó un fragmento del gen TFR (receptor de transferrina) como control interno de expresión.
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Figura 4 - fiogf49gjkf0d Expresión génica de p14/ARF en líneas celulares de neuroblastoma.
Geles de agarosa al 2,5% teñido con bromuro de etidio (0,1 μg/ml). Se utilizó cDNA humano normal de pulmón como control positivo. M: marcador de peso molecular (1Kb Plus Ladder, Invitrogen). Se amplificó un fragmento del gen TFR (receptor de transferrina) como control interno de expresión.
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Conclusiones
Los datos obtenidos sugieren que las alteraciones del gen p14/ARF estarían poco implicadas en la génesis o progresión de los tumores neuroblásticos. Se requieren más estudios para demostrar si otros genes de la ruta p53-MDM2-p14/ARF participan en el desarrollo del neuroblastoma.
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Bibliografía
1. Jaime Mora, William L. Gerald, Jing Qin and Nai-Kong V. Cheung. “Molecular Genetics of Neuroblastoma and the Implications for Clinical Management: A Review of the MSKCC Experience”. The Oncologist 6: 263-268, 2001. 2. Shimada H, Ambros IM, Dehner LP, Hata J, Joshi VV and Roald B. “Terminology and morphologic criteria of neuroblastic tumors: recommendations by the Internacional Neuroblastoma Pathology Committee”. Cancer 86(2): 349-363, 1999. 3. Keshelava N, Zuo JJ, Chen P, et al. Loss of p53 function confers high-level multidrug resistance in neuroblastoma cell lines. Cancer Res 2001;61:6185–93. 4. . Robertson KD, Jones PA. The human ARF cell cycle regulatory gene promoter is a CpG island which can be silenced by DNA methylation and down-regulated by wild-type p53. Mol Cell Biol 1998;18:6457–73. 5. Tweddle DA, Pearson AD, Haber M, et al. The p53 pathway and its inactivation in neuroblastoma. Cancer Lett 2003;197:93–8.
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Comentarios
- Zurama Eloisa Castro Castro (24/12/2007 17:18:40)
Es conocido las alteraciones que pueden acarrear la Hipermetilacion asi como la Acetilación del DNA como factores que favorecen la proliferacion celular asi como los pasos acelerados en las etapas G1 y G2 del Ciclo celular , considero este trabajo un gran aporte en los estudios de los cambios estructurales en el DNA asi como las estruturas codificadas y posisbles alteraciones funcionales.
Dra. Zurama Eloisa Castro
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