Efectos neuroprotectores de una formulación nasal de Eritropoyetina (EPOhr-bas) sobre la isquemia cerebral. II. Modelo de Isquemia Bilateral Transitoria

Nelvys Subirós-Martínez^[1], Rosa María Coro-Antich^[1], Jorge Daniel García-Salman^[1], Iliana Sosa-Testé^[2], Yuneidys Mengana-Tamos^[2], Julio César García-Rodríguez^[2], A. Muñoz-Cernada^[3], Y. Nuñez-Figueredo^[3], Z. Pardo-Ruiz^[3], J. Cruz-Rodríguez^[4]
(1) Instituto de Neurología y Neurocirugía CUBA
(2) Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio CUBA
(3) Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos CUBA
(4) Centro de Inmunología Molecular CUBA

Resumen

Introduccion    

Actualmente existen numerosas evidencias sobre las propiedades neuroprotectoras de la Eritropoyetina humana recombinante (EPOhr). Estos efectos se han demostrado en modelos de isquemia cerebral, trauma mecánico, epilepsia, encefalomielitis autoinmune experimental¹, entre otros².

Aunque todavía se investiga el mecanismo neuroprotector de la EPO, se ha planteado que potencia mecanismos antiapoptóticos, antioxidantes, además de tener acción neurotrófica, anti-inflamatoria, angiogénica y moduladora de la actividad neuronal³.

Hasta el momento existe un único estudio en humanos con ictus isquémico agudo, en el cual se administraron altas dosis de EPOhr por vía endovenosa. Este tratamiento mejoró el estado neurológico de los pacientes tratados con respecto a los controles⁴.

Sin embargo el uso clínico de esta molécula puede obstaculizarse por el posible riesgo de estimulación de la eritropoyesis. Debido a la baja transferencia hacia el sistema nervioso central (SNC) a través de la barrera hemato-encefálica (BHE) es necesario aplicar altas dosis para alcanzar concentraciones neuroprotectoras en el tejido cerebral. El aumento del hematocrito y de plaquetas reactivas como consecuencias de esta actividad hematopoyética, son efectos indeseados en una situación de isquemia cerebral.

Para superar estas desventajas se han desarrollado derivados de EPOhr, con el objetivo de que retengan la acción neuroprotectora pero no estimulen la médula ósea. Entre estos derivados está la asialo-EPOhr, que no incrementa el hematocrito en roedores y mantiene un amplio espectro de actividades neuroprotectoras en modelos de isquemia cerebral, trauma de la médula espinal y neuropatía periférica⁵.

Otra opción puede ser el uso de vías de administración alternativas como la vía nasal. En los años recientes la administración nasal ha ganado importancia como vía de entrada de agentes terapéuticos al encéfalo⁶. Aunque todavía no se conocen bien los mecanismos de transporte, se postula que existe un paso desde la región olfatoria hacia el parénquima cerebral y/o líquido cefalorraquídeo (LCR), sin tener que atravesar la BHE^{6, 7}. Además, se ha comprobado que la vía nasal es más rápida que la endovenosa^{7, 8}. Por estas razones se ha sugerido que la vía nasal puede ser un método no invasivo para tratar la isquemia cerebral.

En este trabajo se produjo una isquemia cerebral global en el gerbo de Mongolia, lo cual modela una situación de paro cardiaco. En esta situación  se produce un cese casi completo del flujo sanguíneo cerebral, lo que provoca daño neuronal selectivo⁹.

En este modelo, la restauración del flujo sanguíneo a la región isquémica (reperfusión) causa daño tisular adicional, el cual se produce fundamentalmente por el exceso de radicales libres.

Varios estudios sugieren una acción antioxidante de la EPOhr por reducción de la peroxidación lipídica y el restablecimiento de las actividades de la catalasa citosólica y la glutatión peroxidasa en eritrocitos^{10, 11}.

El objetivo de este trabajo fue estudiar el posible efecto neuroprotector de una formulación específica de EPOhr con bajo contenido de ácidos siálicos aplicada por vía nasal en un modelo de isquemia bilateral transitoria (isquemia global) en gerbos de Mongolia.

Material y Métodos    

Animales: Se emplearon gerbos de Mongolia machos (entre 60 y 80 g de peso), procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio. El protocolo se analizó y aprobó por el Comité de Ética Institucional¹². Todos los animales tuvieron libre acceso al agua y al alimento, con un ciclo de 12 horas luz / oscuridad.

Los animales se distribuyeron aleatoriamente en 3 grupos experimentales: un grupo control al que solamente se les aislaron las ACC (Control; n=6); un grupo isquémico que se trató con el vehículo de la formulación (IT-V; n=11) y un grupo isquémico que se trató con EPOhr-bas (IT-EPO; n=11).

Formulación nasal de EPOhr-bas: La EPOhr-bas fue suministrada por el Centro de Inmunología Molecular (La Habana), a una concentración entre 0.5 y 1.5 mg/ml.. Se empleó el polímero bioadhesivo D-hidroxi-propilcelulosa, para aumentar el tiempo de residencia de la formulación en la cavidad nasal y disminuir su eliminación por el movimiento ciliar. Se utilizó un buffer para estabilizar el pH, preservo e isotonizante (patente SP #20050138)¹³. En lo adelante las referencias al vehículo incluyen todos los componentes de la formulación excepto la EPOhr-bas.

Procedimiento quirúrgico: Los animales se anestesiaron con halotano con una mezcla de N₂O:O₂ Las operaciones se hicieron con ventilación espontánea y los gases anestésicos se administraron a través de una máscara facial. La temperatura rectal se mantuvo en 37 ± 0.2º C mediante un controlador de temperatura “Digisense” (Cole-Parmer, Barnant Company, USA). Se ocluyeron las arterias carótidas comunes de ambos lados durante 10 minutos. Se retiraron las pinzas y se verificó visualmente la normalización del flujo sanguíneo carotídeo (Fig. 1).

Evaluación del estado neurológico: A las 24 horas de la operación se determinaron los signos clínicos de infarto. Se utilizaron los criterios de Lawner y cols.¹⁵ para establecer una escala cuantitativa. A la puntuación que alcanzó cada animal se le denominó Grado Neurológico (GN) (Ver tabla 1 del trabajo 770 de este congreso). Los datos de GN se analizaron con la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Mann-Whitney cuando hubo significación estadística.

Evaluación conductual: A los 7 días de la operación se registró la actividad exploratoria que manifiestan los animales cuando se colocan en un ambiente nuevo (“open field”, en lo adelante “campo abierto”¹⁶). Se contó el número de empinamientos durante 9 minutos, subdivididos en 3 intervalos. Se compararon los valores de las pendientes de las rectas de mejor ajuste (rectas de habituación) con la prueba de Kruskal-Wallis seguida por la de Mann-Whitney.

Resultados    

Evaluación conductual

En los 3 grupos se observó una tendencia a disminuir la proporción de empinamientos con el decursar del tiempo; sin embargo, las pendientes de las rectas de habituación del grupo control fueron más negativas que las de los grupos IT-V e IT-EPO (estos últimos no se diferenciaron entre sí) (Fig. 3).

Evaluación histológica

Estudio cualitativo

En el grupo control no se encontraron lesiones histopatológicas.

Grupo IT-V:

En 8 de los 11 animales se encontró daño irreversible en las regiones CA1, CA2, CA3 y CA4 del hipocampo de ambos hemisferios (Fig. 4). En los 3 restantes el daño en estas regiones se observó en uno de los hemisferios.

En el hipocampo las lesiones se caracterizaron por muerte neuronal selectiva y aumento del número de microglias. Las neuronas granulares del giro dentado permanecieron intactas (Fig. 4).

Las neuronas piramidales del hipocampo se observaron eosinofílicas, en procesos de cariorrexis, cariolisis y otras en estado de “células fantasmas” ¹⁹. La existencia de espacios vacíos reveló posible pérdida neuronal.

En el núcleo caudado-putamen de ambos hemisferios se observaron áreas extensas de infarto, con presencia de abundantes acúmulos de macrófagos (Fig. 5).

Discusión    

El modelo de isquemia cerebral global en gerbos se ha utilizado ampliamente en estudios de neuroprotección, debido a la relativa facilidad con que se puede inducir la isquemia, con lesiones altamente reproducibles²⁰.

En este trabajo, los resultados del estado neurológico y la evaluación histológica de áreas como CA2, CA3 y CA4 del hipocampo, ponen de manifiesto un efecto neuroprotector en los animales tratados con EPOhr-bas por vía nasal.

En los animales tratados con el vehículo de la formulación (IT-V) se observaron las lesiones histológicas características del modelo. Además de la necrosis de CA1, se encontró degeneración neuronal en el resto de las regiones del hipocampo y se observaron áreas de infarto en gran parte del caudado-putamen. Estas lesiones se caracterizaron por una alta reproducibilidad, lo cual concuerda con descripciones previas del modelo con el mismo tiempo de oclusión²¹.

Sin embargo, en este trabajo el tratamiento con EPOhr-bas no atenuó la disfunción cognitiva. En la prueba de campo abierto, los animales IT-V e IT-EPO mostraron pérdida de habituación. El tratamiento tampoco mostró indicios de efecto neuroprotector en la región CA1 del hipocampo.

Otros autores han encontrado que la EPOhr por vía cerebroventricular y endovenosa atenúa la discapacidad de aprendizaje inducida por isquemia global transitoria^{10, 22} y rescata a las neuronas piramidales del sector CA1 del hipocampo^{23, 24}.

Una de las diferencias del presente trabajo con la literatura es el tiempo de oclusión de las carótidas. En la mayoría de los trabajos citados anteriormente se emplearon 3 minutos de isquemia global, a diferencia de los 10 minutos de oclusión establecidos para el presente experimento.

Se sabe que el desarrollo de infarto y/o muerte neuronal selectiva después de una isquemia transitoria depende de la duración del episodio isquémico, entre otros factores²⁵. Veinte minutos de isquemia global en el gerbo causan muerte celular masiva en el hipocampo y en el caudado-putamen, sin afectar las células granulares del giro dentado²⁶. Una isquemia de 5 minutos provoca muerte retardada en casi todas las neuronas piramidales de CA1, sin afectar otras poblaciones neuronales²⁷. La isquemia por oclusión durante 3.5 minutos provoca un 75% de muerte celular en CA1 a los 7 días^{10, 22}, mientras que la oclusión por 2 minutos no genera un daño detectable²⁶.

El hipocampo, especialmente el sector CA1, se ha reportado como una de las áreas más vulnerables a la isquemia cerebral²⁸. Esta misma razón podría explicar el hecho de que al aumentar el tiempo de isquemia, las neuronas de CA1 se vuelvan menos sensibles a un tratamiento neuroprotector.

En este trabajo los resultados similares en la prueba de campo abierto de los grupos IT-V e IT-EPO podrían estar influidos por la no recuperación de las neuronas de CA1. Esta prueba evalúa la memoria de trabajo a corto plazo, para la cual es preciso que todas las sinapsis sean funcionales. Además, se ha demostrado que la muerte neuronal en CA1 es suficiente para desarrollar un déficit cognitivo^{29, 30}.

El efecto protector que se evidenció en otras regiones del hipocampo como CA2, CA3 y CA4 puede deberse a que son zonas menos vulnerables a la isquemia, y por tanto más sensibles a la acción de la EPOhr-bas.

El posible mecanismo mediante el cual la EPOhr-bas administrada por vía nasal pudo ejercer estos efectos protectores podría estar vinculado con sus propiedades antioxidantes. En la isquemia-reperfusión se produce un daño importante por la excesiva formación de radicales libres³¹. La EPOhr, al igual que el factor de crecimiento derivado de plaquetas, puede incrementar las actividades de las enzimas superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa y catalasa en neuronas^{10, 11}. La EPOhr también puede inhibir la formación de óxido nítrico²³. De esta manera la EPOhr-bas podría aumentar las defensas antioxidantes de las células neurales y por tanto reducir los efectos deletéreos de los radicales altamente reactivos.

El objetivo fundamental de la neuroprotección, no solo para los pacientes con ictus isquémico, sino también con otras enfermedades del SNC, es proteger la función neural. La estrategia de emplear neuroprotectores endógenos como tratamiento del daño al SNC es relativamente reciente. De acuerdo con varios autores, la administración de moléculas protectoras como la EPOhr es una alternativa terapéutica potencial para contrarrestar los daños isquémicos agudos^{32, 33}.

El neuroepitelio olfatorio es la única estructura en el organismo de los mamíferos en que las neuronas primarias están directamente en contacto con el medio externo³⁴. Actualmente se sabe que varias sustancias llegan al SNC por inhalación⁸, habiéndose reportado el paso de moléculas tróficas y neuroprotectoras por esa vía^{35, 36}.

Los resultados de este trabajo sugieren que la administración de EPOhr-bas en gotas nasales llega al encéfalo y puede ejercer efectos neuroprotectores en el modelo de isquemia cerebral global, lo que se refleja en un mejoramiento significativo de algunas de las variables funcionales y morfológicas analizadas

Conclusiones    

Bibliografía    

Referencias Bibliográficas

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Comentarios

- Mirta Garcia Jardon (30/05/2007 12:20:40)

Felicitaciones a los autores. Gracias por compartir con nosotros sus resultados!