9º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

Nº 733. Comunicación libre

Direccion de contacto
Dr. Jorge Ugalde Puyol. Instituto del Cancer SOLCA CUENCA. jugalde@uazuay.edu.ec, jugalde@etapaonline.net.ec

DETECCIÓN DE DNA DEL VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO MEDIANTE PCR EN PACIENTES CON CITOLOGIA DE ASC-US.

Gabriela Picón C.^[1], Isabel Sanchez.^[2], Alfredo Campoverde^[2], Leoncio Cordero J.^[3], Jorge Ugalde P.^[4]
(1) Médico Residente II. Postgrado de Anatomía Patológica. INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA ECUADOR
(2) Departamento de Biología Molecular. INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA ECUADOR
(3) Patólogo. INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA. ECUADOR
(4) Jefe del Departamento de Anatomía Patológica. INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA ECUADOR

Resumen

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El cáncer cérvico-uterino es el segundo en frecuencia en la población femenina mundial. El 80% de éstos se presentan en países en vías de desarrollo, en nuestro medio (Cuenca) la tasa estandarizada es del 22,1 x 100000 al año 2002. (11). La infección uterina por HPV es una enfermedad de transmisión sexual; en la mayoría de las mujeres con HPV, la infección se produce antes de los 25 años. El diagnóstico de ASC-US por citología comprende aquellos casos que tienen características definidas, en las células epiteliales. Su relación con el HPV ha sido estudiada.

Nuestro objetivo es determinar la presencia de HPV y subtipos mediante biología molecular (PCR) en pacientes diagnosticadas de ASC-US por citología en nuestro Instituto.

Resultados: las muestras positivas para HPV fueron del 55.71%, la variedad de genoma de alto grado fue el más frecuente con el 31,43% y el subtipo 16, representó el 19.23% de la muestra, seguida de las variedades 52 y 56.

Discusión: El diagnóstico de ASC-US no debe ser mayor del 3%, de los estudios citológicos, la frecuencia de presencia de genoma viral es alto, situación demostrada en la literatura; el genoma oncogénico de alto grado es el más frecuente. Los estudios sistematizados, citológicos y moleculares, deben ser planteados como parte de los protocolos en la patología cervical.

ABSTRACT:

In world’s female population, uterine cervical carcinoma has the second rate of frequency. 80% of the cases are present in developing countries. In Cuenca, Ecuador, the standardized rate is 22.1 x 1000000 at 2002 (11). HPV uterine infection is a sexual transmission disease. The majority of women who present this illness are infected before the age of 25. ASC-US cytological diagnosis includes cases with well defined characteristics in epithelial cells. The relationship between these factors has been previously studied.

The aim of the present work was the detection and typing of HPV by means of PCR techniques. This study has been carried out with patients ASC-US positive diagnosed by cytology in Cancer Institute SOLCA-Cuenca.

Results: 55.71% of the samples studied were HPV positive. High grade genome variety was the most frequent (31.43%). Subtype 16 represented 19.23% of the sample, followed by types 52 y 56.

Discussion: ASC-US diagnosis must not be greater than 3% in cytological studies. Viral genome frequency is high, as is cited in literature. High grade oncogenic genome is the most frequent of the types described. Systematic studies, cytological and molecular must be presented as protocols of cervical patology.

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- Resumen

- Introduccion

- OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

- BIOLOGIA MOLECULAR:

El cáncer cérvico-uterino es el segundo en frecuencia en la población femenina mundial. El 80% de éstos se presentan en países en vías de desarrollo, con una tasa de incidencia de 44,2 x 100000 habitantes; en nuestro cantón (Cuenca) la tasa estandarizada es del 22,1 x 100000 hasta el 2002. (11)

La infección uterina por HPV es una enfermedad de transmisión sexual; en la mayoría de las mujeres la infección se produce antes de los 25 años, suele durar 8-10 meses y en condiciones de inmunidad habituales es eliminada en la mayoría de los casos, solo en el 10% la infección permanece hasta los 35 años (1-2), el cuello uterino es el órgano diana para este tipo de infecciones potencialmente graves, que puede llevar al desarrollo de un carcinoma invasivo y que, por si solo, es responsable de aproximadamente el 5% de muertes por cáncer en la mujer. (3) Es una infección frecuente en la especie humana, existe una gran variedad de lesiones desde la común y benigna verruga vulgaris hasta el cáncer cervical (4). La tasa de mortalidad por cáncer cérvico uterino ha ido disminuyendo debido a la aplicación de programas de prevención citológica.

El diagnóstico de ASC-US comprende aquellos casos que tienen características definidas en las células epiteliales, no debe rebasar del 3%, de los estudios citológicos, depende de los criterios diagnósticos utilizados y de la experiencia del observador. Este diagnóstico abarca aquellos cambios citológicos que, aunque son claramente anormales, no son lo suficiente severos como para hacer el diagnóstico de una lesión intraepitelial escamosa, son más severos que los vistos en la categoría de cambios celulares benignos. (6) El Sistema Bethesda indica que, para informar la citología cervical se deberá ver cambios en células maduras como diferenciación escamosa, aumento de la relación núcleo-citoplasma e hipercromasia nuclear con cromatina granular fina, uniformemente distribuída y contornos nucleares finos. (7). La Sociedad Americana de Colposcopía y Patología proponen que, la consecuencia de éste informe (ASC-US) debe ser la búsqueda del HPV oncogénico. Si resulta negativa, no es necesario remitir a la paciente a colposcopía ni a biopsia ya que el valor predictivo negativo del HPV es de casi un 100%. (7)

El HPV es un virus epiteliotropo del grupo Papovaviridae; hasta el momento se han aislado cerca de 100 tipos de HPV que incluyen aquellos de bajo y alto riesgo oncogénico, mencionándose también un riesgo intermedio. Al grupo de bajo riesgo pertenecen el 6,11,40,42,43,44,54,61,70,72,81, los de alto riesgo son el 16,18,35, 39,45,51,52,56,58,59,68,73,82 y los de riesgo intermedio el 31, 33. Los denominados de bajo riesgo se relacionan con lesiones benignas y condilomas, en cambio los de alto riesgo están relacionados y se los encuentra en lesiones intraepiteliales y cáncer de cuello siendo el tipo 16 el de mayor frecuencia (8-9).

En la actualidad las técnicas de biología molecular permiten el diagnóstico certero de infección por virus del papiloma humano basándose en el análisis de secuencias de DNA viral que puede ser realizado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con una sensibilidad y especificidad muy altas; permitiéndonos diagnosticar VPH mucho tiempo antes que la lesión celular se haga evidente y que sea observada por el estudio citológico.

El presente estudio es de tipo descriptivo transversal con una muestra de 70 pacientes del Instituto del Cáncer SOLCA-Cuenca, con diagnóstico citológico de ASCUS, en los años 2005-2006, investigando la presencia de genoma viral, la frecuencia y sus variedades genómicas.

El análisis se realizó en base pruebas estadísticas de frecuencia absoluta y relativa.

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- OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

- BIOLOGIA MOLECULAR:

OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

OBJETIVO Determinar la presencia de HPV y sus tipos mediante biología molecular (PCR) en pacientes diagnosticadas de ASC-US por citología en el Instituto del Cáncer de SOLCA-Cuenca durante los años 2005-2006.

MATERIALES Y METODOS Se revisaron 70 registros de pacientes con diagnóstico de ASC- US en el sistema de cómputo e historias clínicas en el departamento de estadística, citología y biología molecular del Instituto del Cáncer SOLCA-Cuenca a las que se realizó PCR. La información se ingresó en una base de datos en Microsoft EXCEL para su tabulación presentación y análisis. Las variables fueron: edad, positividad a HPV y subtipo viral.

El estudio citológico se realiza mediante técnica de PAP convencional, observado por el Departamento de citodiagnóstico de la institución y siguiendo los criterios de Bethesda (Figura 1 . Y 2.).

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Figura 1 . -

Figura1. CITOLOGIA ASC-US. PAP.

Y 2. - <div style= fiogf49gjkf0dFigura 2. PAP. ASC-US.">
Y 2. -

Figura 2. PAP. ASC-US.

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- OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

- BIOLOGIA MOLECULAR:

La detección del virus se realizó utilizando la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con primers universales MY09-11, lo que dio un fragmento aproximado de 450 pb y primers L1C1-L1C2 que genera un fragmento de 240-250 pb. (Figura 3)

El resultado se visualizó por medio de un gel de agarosa al 3% con tinción de Bromuro de Etidio.

La tipificación se realizó siguiendo el protocolo de propuesto por K.Sotlar y colaboradores utilizando la técnica Nested multiplex PCR con el cual se puede identificar genotipos de alto riesgo como: 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68 y los genotipos de bajo riesgo 6/11,42,43,44. (Figura 4)

FIG. 3. Gel de agarosa 2%. Regiones MY-L1C1. Positivo 41 43, derecha C+ para MY (450pb). Positivo 41 43, derecha C+ para L1C1 (261pb).

Figura 4 - <div style= fiogf49gjkf0dfig 4. Subtipos. Positivo: 50 HPV 18 (322pb), 57 HPV 16 (457pb), 58 HPv 16 (457pb). Derecha en blanco C+-.">
Figura 4 -

fig 4. Subtipos. Positivo: 50 HPV 18 (322pb), 57 HPV 16 (457pb), 58 HPv 16 (457pb). Derecha en blanco C+-.

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- OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

- BIOLOGIA MOLECULAR:

La muestra es de 70 mujeres con una edad comprendida entre los 19 y 78 años con una media de 44 años; procedentes de zona urbana como rural que acuden al instituto para control de cáncer.

Tabla # 1

PACIENTES CON DIAGNOSTICO DE ASCUS DE ACUERDO A EDAD Y HPV.

INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA. 2005-2006

	HPV
EDAD	NEGATIVO	PORCENTAJE	POSITIVO	PORCENTAJE	TOTAL GENERAL	PORCENTAJE
19-28	2	2,86	2	2,86	4	5,71
29-38	5	7,14	7	10,00	12	17,14
39-48	11	15,71	14	20,00	25	35,71
49-58	10	14,29	8	11,43	18	25,71
59-68	3	4,29	6	8,57	9	12,86
69-78		0,00	2	2,86	2	2,86
Total general	31	44,29	39	55,71	70	100,00

Fuente: Base de datos instituto.

De la serie de 70 pacientes se detectó HPV en 39 (55,71%). La distribución esta entre los 29 y 58 años, el grupo esta comprendido entre los 39-48 años con un porcentaje del 20% de todos los casos y el 35,71% de los casos positivos.

Tabla # 2

PACIENTES CON DIAGNOSTICO DE ASCUS Y HPV DE ACUERDO AL GRADO PONTENCIALIDAD ONCOGENICA.

INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA DURANTE LOS AÑOS 2005-2006

HPV
GRADO	Total	PORCENTAJE
ALTO GRADO	22	31,43
BAJO GRADO	4	5,71
GRADO INTERMEDIO	13	18,57
NEGATIVO	31	44,29
Total general	70	100,00

Fuente: Base de datos instituto.

Las muestras de 22 pacientes fueron positivas para DNA viral de alto grado (31.43%); para grado intermedio 13 casos (18.57%); bajo grado 4 (5.71%) y fueron negativos 31 casos (44,29%).

Tabla # 3

PACIENTES CON DIAGNOSTICO DE ASCUS Y HPV DE ACUERDO AL TIPO DE HPV.

INSTITUTO DEL CANCER SOLCA-CUENCA DURANTE LOS AÑOS 2005-2006

	HPV
TIPO	Total	PORCENTAJE
16	5	19,23
18	1	3,85
35	2	7,69
39	2	7,69
42	1	3,85
43	3	11,54
45	1	3,85
52	4	15,38
56	3	11,54
58	1	3,85
68	3	11,54
Total general	26	100,00

Fuente: Base de datos instituto.

La tabla # 3 presenta los subtipos de HPV observados mediante PCR, de las 26 pacientes en la que se pudo realizar subtipificación, se observa una variabilidad de tipos de genoma viral, con un predominio del 16, que representa el 19,23%; seguido por las variedades 52 y 56.

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- OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

- BIOLOGIA MOLECULAR:

El carcinoma de cuello uterino representa la segunda patología en nuestro medio, después del cáncer de piel en la mujer, nuestra tasa es de 22,1 por 100000 H; en Chile la tasa de incidencia es de 42 por 100000 H (11). La citología cervical es una técnica confiable para el diagnóstico de lesiones preinvasivas, objetivo fundamental en oncología, Bethesda en el 2001 normaliza ASC-US como grupo citológico definido; Almeida y colaboradores valoran 346 citologías con ASC-US mediante estudio citológico comparativo, encontrándose un índice de concordancia de un 80%. La aplicación de la biología molecular en la observación de genoma de HPV, ha demostrado una prevalencia global de la infección por este virus en aproximadamente el 40% de los casos (Lacruz C), nosotros observamos en el 55,71%, creemos que la prevalencia aumentada está en relación a nuestra tasa de incidencia relacionada con el cáncer cervical. La edad de presentación de las lesiones citológicas suelen ser más tardías que la presencia del genoma viral a nivel genital, García y col, observan lesiones citológicas de ASC-US entre los 18 y 48 años, nuestro grupo mayor está entre los 39 y 48 años correspondiendo al 20%. Otro factor a considerar puede ser la presentación de factores de riesgo más tardíos. El tipo viral observado con mayor frecuencia, de acuerdo al grado de agresividad es el de alto grado con un 31.43%, dato que concuerda con lo encontrado en el estudio realizado por Lacruz, y col. en donde el HPV de alto grado es el que predomina (9). La mayoría de pacientes de nuestro estudio presentó un HPV tipo 16 (19,23%), que concuerda con lo observado en otros estudios (7 9 10). García y col. en su investigación muestran una frecuencia del 19,95% para HPV de alto riesgo y del 5;29 para bajo riesgo, los hallazgos variables pueden deberse a múltiples factores que deben ser analizados mediante variables de importancia ambiental. En conclusión: la detección de HPV y su tipificación debe añadirse a los estudios de lesiones cervicales preinvasivas, con el fin de reducir el número de mujeres referidas a tratamiento con múltiples controles por citologías anormales (ASC-US) así como para predecir con mayor precisión el riesgo potencial de la lesión.

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- OBJETIVO, MATERIALES Y METODOS:

- BIOLOGIA MOLECULAR:

1 - Gämez e; Gämez m, Conde S, Maganto E, Navío S, Allona A, Infección por papiloma virus en el Hombre. Estado actual. Servicio de Urología, Servicio de microbiología, Hospital Ramón y Cajal . Madrid-España. 2005 365-362.

2 - Binkin,N.J., Kaplan,J.P., Cabes,W. PRC Venting Neonatal Herpes. The Value of Weekly Viral Cultures in Pregnant Women with Recurrent Genital Herpes. Jama 1994; 251:2816.

3 - Vinay Kumar , Abul Abbas, Nelson Fausto, Patología estructural y funcional, Séptima edición . Madrid-España, 2006.

4 - Gutierrez E, Witvrun J, Sanchez G, Gaspar J, Garza F, Cerda F, Detección moledcular del Virus del Papiloma Humano en mujeres con condilomas cervicales tratadas con ácido acético. Revista de Gineco obstetricia, Vol 73, num 3, Mexico, marzo 2005.

5 - Solomon D, Nayar R, Definiciones, criterios y notas aclaratorias. El sistema Bethesda para informar la citología cervical. Ediciones Journal, New York.2005.

6 - Barbara S, Zoschnick L, The 2001 Bethesda System Terminology. Am. Fam. Physician. 2003.

7 - García J, Vilaplanna E, López D, Meisels A, Vilaplana E, ASCUS en citologìa cervicovaginal de rastreo y captura Hìbrida II, Revista Española de Patología 2003; Vol 36, nº 1:59-64.

8 - Almirón S, Navarro S, Rojas M, Szczerba S, Martín M, Correlación Citohistológica de la expresión de la infección por virus del papiloma humano en lesiones premalignas y malignas del cuello uterino, Revista de Patología num 134 México. 2003.

9 - Lacruz C, Martino B, Alvares E, incidencia de los diferentes tipos de papiloma virus humano (HPV) en las lesiones escamosas del cérvix uterino, Revista Española de Patología, 2003, Vol 36, n°1, 2003.

10 - Sotlar D, Diemer A, Detheleffs Y, Hack A, Detection and Typing of Human Papilomavirus by E6 Nested Multiplex PCR, Jorunal of Clinical Microbiology, July 2004, Vol 42, n° 7, 3176-3184.

11 - Fabián Corral C, Patricia Cueva A. José Yépez; Epidemiología del Cáncer en Quito y en otras regiones del Ecuador, Registro nacional de tumores, Quito-Ecuador. 2004.

12 - Lacruz C, Fariña J, Citología Ginecológica, de Papanicolaou a Bethesda, Editorial Complutense, España 2003.

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- Victor Leonel Argueta Sandoval (07/05/2007 3:24:57)

Los resultados nos indican que no debemos de menospreciar esos casos en los que no tenemos todos los criterios de neoplasia, pero hay cambios fronterizos, que bien caen en ASCUS.

- Julio Alexander Diaz Perez (07/05/2007 15:00:32)

Muy buen estudio descriptivo, tienen la información necesaria para realizar ciertos análisis, pueden por ejemplo validar el diagnostico citológico de ASCUS con prueba de referencia PCR

- JULIO CESAR LESCANO SORIANO (10/05/2007 22:44:33)

FELICITACIONES POR EL TRABAJO PRESENTADO SOBRE DETEC, DE DNA VIRAL DEL VPH,POR MEDIO DE PCR.; NOS INDICAN QUE EL ESTUDIO DE ASCUS SIGUE VIGENTE Y QUE SE DEBE ESTUDIAR BIEN LA PATOLOGIA CERVICAL,EN LOQUE CANCER DE CUELO UTERINO POR INFECCION DE PVH., YA QUE MUCHAS VECES SE DEJA PASAR UN MAL DIAGNOSTICO ,Y QUE GRACIAS A LA BIOLOGIA MOLECULAR Y LOS ESTUDIOS DE CITOLOGIA CERVICAL,SE PUEDEN HACER UN MEJOR ESTUDIO ,YA QUE ES UNA DE LAS ENFERMEDADES MAS PREVALENTES QUE EXISTEN EN NUESTROCONTINENTE; SE RESALTA LA INVESTIGACION.

- Tatyana Omaña (14/05/2007 0:05:22)

Hola Felicitaciones es un trabajo bastante interesante, una vez más nos damos cuenta que si se trabaja en equipo los resultados se mejoran un cien por ciento.En nuestro país la edad de mayor incidencia en comparación con ustedes es en mujeres más jóvenes(18-35).Aun no empleamos técnicas de biologia molecular en nuestro laboratorio pero de seguro en un futuro no muy lejano lo implementaremos.Gracias.

- Mireyi Meriño Martínez (25/05/2007 17:47:44)

Estudios como estos demuentran la importancia del seguimiento de infecciones como las del PVH en el diagnóstico y pronóstico de lesiones malignas a nivel cervical que lamentablemente afecta a un buen número de la población femenina de nuestro continente. Felicidades. Saludos, Mireyi.

- Dania Ledesma (28/05/2007 5:57:21)

Muy interesante su trabajo.
Les felicito.

- MC ROCIO CASTILLO DIAZ (06/06/2007 19:25:46)

Es muy buen trabajo, felicidades que bueno que incluyeron imagenes, Saludos y gracias por compartirlo.

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