XENOINJERTO ÓSEO DE ORIGEN PORCINO: ESTUDIO EXPERIMENTAL EN CONEJOS

Guillermo Pardo Zamora^[1], José Luis Calvo Guirado^[1], Vicente Vicente Ortega^[2], Nuria Álvarez Sánchez^[2]
(1) Departamento de Clínica Odontológica Integrada de Adultos, Facultad de Medicina y Odontología, Universidad de Murcia, Murcia, España. ESPAÑA
(2) Cátedra de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Universidad de Murcia, Murcia, España. ESPAÑA

Resumen

Objetivos: Realizamos el estudio experimental de la respuesta ósea al implante del nuevo biomaterial de pasta de hueso y colágeno de origen porcino (Osteobiol Putty^®), en conejos de Nueva Zelanda.

Material y métodos: Hemos utilizado 20 conejos albinos Nueva Zelanda de 3.900-4.500 g y de 30-35 semanas. Implantamos en la zona proximal metafisiaria de las tibias traseras, en lechos óseos de 4x3,5 mm, 40 implantes de pasta de hueso libre de antígenos con un 80% de gránulos de hueso de entre 125-200 μm, y un 20% de colágeno puro tipo I. Realizamos 4 Grupos: I (1 mes); II (4 meses); III (8 meses); IV (15 meses). Tras el sacrificio procedimos al estudio radiológico (anteroposterior y lateral) de las tibias con los implantes y al estudio microscópico óptico. Realizamos secciones de 5 μm que fueron teñidas con H.E., tricrómico de Masson y reticulina de Gordon-Switt.

Resultados y Discusión: Nuestro experimento confirmó la biocompatibilidad del Osteobiol Putty^® por la escasa respuesta inflamatoria observada y sólo en los primeros estadios, caracterizada por la presencia de macrófagos aislados y linfocitos dispersos. No observamos fibrosis entre los implantes y el hueso; también la capacidad osteoconductora de los implantes que actuaron como andamiaje para las células óseas; a partir del 4º mes observamos marcada disminución del volumen del implante junto a la presencia progresiva de crecimiento óseo en el interior y alrededor de los implantes, así como fenómenos de sustitución del tejido osteoide por médula ósea adiposa y hematopoyética, demostrándose la reabsorción parcial y progresiva del biomaterial.

Conclusión: La pasta de hueso y colágeno Osteobiol Putty^® ha demostrado biocompatibilidad, ser biorreabsorbible y osteoconductor, y por tanto, un posible sustituto óseo.

Introduccion    

La sustitución del tejido óseo constituye un problema aún no resuelto, que precisa de nuevas investigaciones sobre diversos materiales (metales, polímeros y cerámicas) capaces de reparar dichos defectos así como de estimular el crecimiento del hueso huésped para alcanzar su reparación. Aunque este problema está parcialmente resuelto en el momento actual con la utilización de los injertos óseos; no obstante y dados los problemas intrínsecos que pueden presentar los actuales, tanto los autólogos como los aloinjertos, hacen preciso la búsqueda de nuevos materiales denominados genéricamente como sustitutos de los injertos óseos ¹.

Los xenoinjertos (obtenidos de animales de otras especies) presentan sólo la propiedad de osteoconducción. Este es el proceso por el cual el material implantado proporciona una trama para el crecimiento óseo desde los márgenes del defecto. Dicho material puede ser permanente o reabsorbible. Un material osteoconductor puro no forma hueso de forma intrínseca en implantación ectópica, su osificación no es endocondral, y la formación de hueso siempre comienza en la periferia. El proceso osteoconductivo implica que el material tiene la capacidad de influenciar a células no pluripotenciales del lecho a convertirse en osteoblastos que medien la regeneración ósea. El proceso se diferencia del osteoinductivo en que tiene lugar sobre células predeterminadas y no en células pluripotenciales, con lo que la respuesta a la osteoconducción es limitada a una población celular que ya ha sido programada. El efecto de un material osteoconductor puro sobre la regeneración ósea a partir de la superficie de un hueso nativo es el mismo que el de un material osteoinductivo puro, pero extremadamente limitado e insuficiente en el puenteo de defectos extensos ^2-7.

En este estudio analizamos la respuesta ósea a un xenoinjerto de origen porcino constituido por un 80% de partículas de hueso granulado de un tamaño de 125-200 μm y un 20% colágeno puro en forma de pasta de hueso, colocado en defectos de hueso en tibias de conejos, valorando la intensidad, rapidez y naturaleza de la respuesta. Asimismo pretendemos comprobar si este biomaterial cumple los requisitos de biocompatibilidad y biofuncionalidad y por tanto es un sustituto adecuado de los injertos óseos autólogos.

Material y Métodos    

Hemos utilizado 20 conejos albinos Nueva Zelanda de 3.900-4.500 g, y 30-35 semanas de edad a los que colocamos 40 implantes de pasta de hueso Osteobiol Putty en la zona proximal metafisaria de las tibias traseras.

Bajo anestesia general con clorhidrato de Ketamina (50 mg/kg/im.) (Merial®), Clorpromacina (10 mg/kg/im.) y Atropina (0,3 mg/kg/im.), previa profilaxis antibiótica mediante Amoxicilina (Clamoxyl LA® laboratorios Pfizer) 0,1 ml/kg peso im. Realizamos el abordaje interno en la zona metáfiso-diafisario proximal de la tibia, a varios milímetros por debajo de la tuberosidad tibial anterior, donde realizamos los defectos óseos utilizando una broca quirúrgica de 4 mm de diámetro. Fueron rellenados con el xenoinjerto en forma de pasta. Los 5 conejos de cada grupo fueron sacrificados con una sobredosis de Thiopental intracardiaco: a 1 mes (Grupo I), 5 meses (Grupo II), 8 meses (Grupo III) y 15 meses (Grupo IV) después de la implantación.

Estudio radiológico: Se realizaron dos proyecciones radiográficas (anteroposterior y lateral), de las piezas óseas que contenían los implantes mediante la técnica mamográfica MAMMO-DIAGNOST UC (Philips, Madrid) con película Min-R Screen (Kodak®, Madrid), realizándose radiografías óseas iníciales con 32 Kv, 40 mA, foco grueso y exposimetria automática, para proceder posteriormente a la obtención de imágenes magnificadas 1: 1,7 con 20 Kv, 16 mA, foco fino y expositometría automática sin rejilla antidiafragma.

Estudio microscópico óptico: Las muestras quirúrgicas se fijaron en formol neutro tamponado al 10º y fueron decalcicadas utilizando dos métodos: el tradicional de decalcificación con formol nítrico al 10º y mediante la técnica de TBD-I (Termo-Shandon SA, Pittsburg, USA) durante 2 horas (Ácido hidroclórico 14% y polyvinylpyrrolidone), y con el TBD-II (Ácido fórmico 26% + Citrato sódico 8,5% + polyvinypyrrolidone) durante 17 días, realizando un cambio de líquido cada 24 horas. A continuación se incluyeron en parafina por el método habitual, obteniéndose secciones de 5 μm que fueron teñidas con las técnicas de Hematoxilina-Eosina, Tricrómico de Masson y de reticulina de Gordon-Switt.  

Resultados    

GRUPO I:

En el estudio radiológico las características del material implantado correspondían con la imagen de un elemento cilíndrico de estructura rectangular, de 4 x 6 mm, con una  densidad radiológica superior a la densidad calcio, lo que permite diferenciarlo en el interior de la estructura ósea esponjosa en la que se implantó(fig.l).

El estudio microscópico-óptico demostró a nivel de la zona del implante y el área del defecto óseo creado en la cortical, la sustitución del hueso por tejido de granulación que se extendía hacia la zona del implante introduciéndose en el material implantado, a los que rellenaba parcialmente (fig. 2). Estaba constituido por numerosas yemas endoteliales y vasos sanguíneos de calibre capilar así como abundantes células mesenquimales de morfología irregular con citoplasmas amplios y numerosos fibroblastos dispuestos al azar en el seno de abundante sustancia fundamental, fibras colágenas, macrófagos y linfocitos de distribución dispersa.

GRUPO II:

En el estudio radiológico destacaba que la línea osteoblástica cortical aparecía reparada completamente aunque presentaba una densidad inferior a la del hueso cortical adyacente. La densidad radiológica del material era inferior a la observada en el período anterior, aunque destacaba la presencia de un refuerzo de la densidad radiológica que podía implicar la formación ósea alrededor del implante. El material implantado va perdiendo la forma esférica, adquiriendo una forma más ovalada e irregular (fig. 3).

El estudio anatomopatológico destacaba la reparación ósea casi completa de la cortical perforada para la implantación del xenoinjerto, a expensas de tejido óseo neoformado o inmaduro. Asimismo, la sustitución del xenoinjerto implantado a expensas de trabéculas óseas que eran más extensas y de mayor espesor que las observadas en el periodo anterior, que conferían un aspecto reticular a la zona del implante. No observamos respuesta inflamatoria marcada (fig. 4).

GRUPO III:

En el estudio radiológico las lagunas óseas artificiales en las que se introdujo el implante de hueso en pasta, la cortical externa presentaba una densidad cálcica similar a la de la cortical adyacente, de  modo que era difícil determinar el orificio de entrada. El implante a nivel cortical presentaba disminución de la densidad radiológica respecto al grupo anterior, así como una forma más ovalada con disminución de la densidad calcio en su interior. No presentaba límites radiológicamente bien definidos. En algunas zonas existía una continuidad de la cortical ósea con el material implantado, debido a imágenes lineales de trabéculas óseas que parecen atravesarlo (fig. 5).

El estudio anatomopatológico destacaba la reparación ósea completa de la cortical a nivel del orificio del implante, a expensas de hueso trabecular bien ordenado a nivel de la cortical con aumento de los fenómenos de la remodelación ósea (fig. 6). También observamos menor formación de trabéculas óseas y el aumento marcado de la médula ósea hematopoyética y adiposa en la zona central, que sustituyen parcialmente al tejido de granulación.

GRUPO IV:

El estudio radiológico al final del estudio, en los defectos óseos estudiados como “controles” el aspecto radiológico del hueso es similar al descrito en el grupo anterior; observándose aún, una o más líneas rectilíneas con densidad calcio que cruzan perpendicularmente al hueso en el lugar donde se encontraba el trayecto rectangular de la laguna ósea que artificialmente habíamos provocado.

En los defectos óseos rellenados con el xenoinjerto observamos que la imagen radiológica del implante no presenta una estructura geométrica definida; observándose, además, una disminución del volumen del injerto y una completa reparación del defecto óseo creado. Las imágenes radiológicas trabeculares que llegan hasta el implante son mucho más numerosas y densas que en el periodo anterior y le dan a la zona implantada un aspecto ligeramente reticular (fig. 7).

No se han observado alteraciones óseas cicatriciales ni residuales atribuibles a la presencia del implante. Tampoco se han observado malformaciones óseas ni cambios estructurales en el desarrollo del hueso durante los meses estudiados.

En este periodo el estudio anatomopatológico se caracterizaba por la presencia de hueso óseo maduro en la cortical de la zona de entrada del implante, de modo que no podía diferenciarse de la cortical adyacente. También observamos remodelación ósea con reordenación de trabéculas óseas alrededor del implante, fenómenos que eran más destacados en las proximidades de la cortical (fig. 2d). Los implantes en este periodo han disminuido de volumen de forma apreciable hasta su reabsorción casi total, persistiendo trazas en la porción central el tejido de granulación, parcialmente sustituido por médula ósea. Asimismo, destacaba la reordenación del conducto medular caracterizada por la orientación en laminillas bien diferenciadas de las fibras de colágena del hueso cortical (fig. 8).

Discusión    

Tradicionalmente se ha utilizado el formol nítrico como técnica de decalcificación ósea; recientemente se están introduciendo la utilización de dos soluciones comerciales denominadas TBD-I® que contienen ácido hipoclorídrico 14% y polyvinylpyrrolidone, y TBD-II® (Ácido fórmico 26% + Citrato sódico 8,5% + polyvinypyrrolidone) que son de habitual uso desde hace unos años en la práctica clínica de diversos hospitales. En nuestro trabajo hemos utilizado ambos métodos, mostrando la técnica del TBD características morfológicas de mayor calidad. Por ello, y a pesar que son escasas las referencias existentes en la bibliografía sobre estudios con las soluciones TBD-I y II ⁸, consideramos que el TBD, constituye un método que presenta mejores resultados que el del formol nítrico en los estudios del tejido óseo.

La implantología actual está consiguiendo un porcentaje de éxito cada vez mayor con el continuo desarrollo de los sistemas de implantes; paralelamente cada vez es mayor la demanda de tratamiento de casos complejos que requieren una regeneración ósea previa mediante el uso de injertos. En este aspecto, el injerto autólogo sigue siendo la mejor opción, sin embargo muchos clínicos buscan alternativas para evitar una segunda zona quirúrgica (sitio donante), un peor postoperatorio y reducir los tiempos quirúrgicos ⁶. Basándonos en esta premisa, muchos estudios demuestran la efectividad obtenida con diferentes biomateriales sustitutos de hueso ⁷.

El material de injerto utilizado en nuestro estudio corresponde al Osteobiol Putty, pasta de hueso libre de antígenos compuesta por un 80% de mezcla granulada con una granulometría entre 125 y 200 μm y un 20% de colágeno puro tipo I de origen porcino constituido por un heterotrímero de dos cadenas idénticas α-1 y una cadena α-2, y un homotrímero de tres cadenas idénticas α-1. Las cadenas α-1 están constituidas por 338 tripletes consecutivos de Gly-Xaa-Yaa donde Gly es la glicina y Xaa y Yaason distintos aminoácidos (con la excepción del triptófano y de la cisteína) siendo en 1/3 de los casos prolina e hidroxyprolina respectivamente. Este biomaterial demuestra una excepcional maleabilidad y plasticidad gracias a su estructura y características que lo hacen sencillo de aplicar presentando poca radiopacidad.

Nuestro experimento ha confirmado la biocompatibilidad del Osteobiol Putty puesto que sólo observamos la existencia de una respuesta inflamatoria poco relevante y en los primeros periodos del estudio, que al mes del implante estaba representada exclusivamente por escasos macrófagos dispuestos de forma aislada, sin constituir granulomas, y por linfocitos dispersos. Tampoco hemos observado fibrosis en el límite entre el injerto y el hueso huésped lo que junto al hecho de observar crecimiento óseo tanto en la periferia como en el interior de los implantes, confirma la capacidad de osteointegración del Osteobiol putty. La biocompatibilidad y capacidad de osteointegración de otras formas de hidroxiapatita ya había sido definida previamente, en estudios sucesivos por distintos autores clásicos ^9-15.

En nuestro experimento también hemos podido demostrar la capacidad osteoconductora de la pasta Osteobiol Putty, que ha actuado de andamiaje para las células óseas y además con una granulometría de 125-200 μm. De esta forma confirmamos lo que había sido descrito previamente por otros autores como Van Blitterswijk ¹⁶ que establecieron una tabla en la que relacionaban el tamaño de poro y granulometría con la cantidad de tejido óseo neoformado, observando que hidroxiapatitas que mostraban poros inferiores a 5 μm comenzaba a formarse hueso. Con hidroxiapatia de tamaño de poro entre 100-160 μm se formaba un 17% de hueso aumentando progresivamente el porcentaje de hueso neoformado hasta llegar a un 96% con tamaños de poro superiores a 276 μm. Concluían que el tamaño del poro y granulometría no debe ser reducido demasiado, ya que tanto el diámetro del poro como las conexiones interporóticas (ventanas) tienen un efecto significativo sobre el tipo y la cantidad de tejido óseo neoformado.

También hemos confirmado los resultados obtenidos por Klawitter y Hulbert ¹⁷ y Schepers ¹⁸  quienes consideraban que la existencia de interporo facilita el crecimiento óseo en su interior. Este hecho lo hemos podido constatar en nuestro experimento, al observado crecimiento óseo no solo en los poros de la superficie sino en los poros del interior del implante, hechos comprobados en la hidroxiapatita, con microscopía óptica y que también han sido descritos recientemente ¹⁹.

Las imágenes radiológicas en los dos últimos periodos, 8 y 15 meses, indican una disminución apreciable del total del volumen, junto a las descripciones realizadas con microscopía óptica que indicaban sustitución de tejido osteoide por médula ósea adiposa y hematopoyética, demuestran la existencia de un fenómeno de reabsorción parcial y progresiva de la pasta de hueso que se hacía más patente a partir del quinto mes después de su implantación. Esta característica había sido descrita en la hidroxiapatita, con anterioridad por otros autores ^20-23.

Conclusiones    

La pasta de hueso Osteobiol Putty se ha comportado como un material biocompatible al provocar exclusivamente una respuesta inflamatoria leve y precoz, osteoconductor al permitir la rápida formación de tejido de granulación que es sustituido por tejido óseo trabecular, tanto en la periferia como en el interior del implante, y también bioreabsorbible, por lo que puede considerarse como sustituto del tejido óseo.

Bibliografía    

1. Andrew H, Crenshaw, Jr. Técnicas y vías de abordaje quirúrgicas. En: Ferry canales S, editor. Campbell cirugía ortopédica. Tomo I. Madrid: Harcourt Brace, SA, 1998; p.43-7.

2. Lekholm U, Adell R, Lindhe J. Marginal tissue reactions at osseointegrated titanium fixtures. A cross-sectional retrospective study. Int J Oral Maxillofac Surg. 1986;15:53-61.

3. Urist MR. Bone:formation by autoinduction. Science 1965;150:893-9.

4. Reddi AH, Weintroub S, Muthukumaran N. Biologic principies of bone induction. Orthop Clin N Am 1987;18:207-12.

5. Burchadt H. The biology of bone graft repair. Clin Orthop 1983;174:28-42.

6. Norton MR, Odell EW, Thompson ID, Cook RJ. Efficacy of bovine bone material for alveolar augmentation: a human histologic study. Clin Oral Implants Res 2003;14:775-83.

7. Hallman M, Nordin T. Sinus floor augmentation with bovine hydroxyapatite mixed with fibrin glue and later placement of nonsubmerged implants: a retrospective study in 50 patients. Int J Oral Mixillofac Implants 2004;19:222-7.

8. Azorit C, Hervas J, Analla M, Carrasco R, Muñoz-Cobo J. Histological thin-sections: a method for micoroscopio study of teeth in Spanish red deer (Cervus elaphus hispanicus). Anat Histol Embryol 2002;31:224-7.

9. Jarcho M, Bolen CH, Thomas MB, Bobick J, Kay J. Hidroxyapatite synthesis and charectization in dense plycristalline form. J Mater Sci 1976; 11: 2027-35.

10. Jarcho M, Kay JF, Gumaer Ki, Doremur RH, Drobeck HP. Tissue, cellular and subcellular events at a bone-ceramic hicroxylapatite interface. J Bioeng 1977;1: 79-92.

11. Jarcho: Calcium phosphate ceramicas as hard tissue prosthetics. Clin Orthop 1981;157: 259-78.

12. Denissen HW, De Groot K, Makkes PCH, Van den Hooff A, Klopper PJ. Tissue response to dense apatite implants in rats. J Biomed Mater Res 1980; 14: 713-21.

13. Ducheyne P, Hench LL, Kagan A, Martens M, Bursens A, Mulier C. Effect of hydroxyapatite impregnation on skeletal bonding of porous coated implants. J Biomed Mater Res 1980; 14: 225-37.

14. Gumaer KI, Sherer AD, Slighter RG, Rothstein SS, Drobeck HP. Tissue reponse in dogs to dense HA implantation in the femur. J Oral Maxillofac Surg 1986; 44: 618-27.

15. Frank RM, Gineste M, Benqué EP, Hemmerle J, Duffort JF, Heughebaert M. Estude ultrastructurale de l'induction osseuse aprés implantation de bioaptites chez l'homme. J Biol Buccale 1987 ;15: 125-34.

16. van Blitterswijk CA, Grote JJ, Kuijpers W, Daems WT, De Groot K. Macropore tissue ingrowth: a quantitative and qualitative study on hidroxyapatite ceramic. Biomaterials.1986; 7:137-43.

17. Klawitter JJ, Hulbert SF. Application of porous ceramics for the attachment of load bearing orthopaedic applications. J Biomed Mater Res. 1971;2:161-229.

18. Schepers E, De Clercq M, Ducheyne P, Kempeneers R. Bioactive glass particulate material as a filler for bone lesions. J Oral Rehabilitation 1991;18: 439-52.

19. Tamai N, Myoui A, Tomita T, Nakase T, Takana J, Ochi T, Yoshikawa H. Novel hydroxyapatite ceramics with an interconnective porous structure exhibit superior osteoconduction in vivo. J Biomed Mater Res 2002;59:110-7.

20. Uchida A, Nade SML, McCartney RE, Ching W. Bone ingrowth into three different porous ceramics implanted into the tibia of rats and rabbits. J Orthop Res 1985; 3: 65-77.

21. Groot de K, Geesink R, Klein CP, Serekian P. Plasma sprayed coatings of hydroxylapatite. J Biomed Mat Res 1987; 21: 1375-82.

22. Minabe M, Sugaya A, Satoy H, Tamura T, Ogawa Y, Hori T, Watanabe Y. Histological study of the dydroxyapatite-collagen complex implants in periodontal osseous defects in dogs. J Periodontol. 1988;59: 671-8.

23. Gatti AM, Zaffe D, Poli GP. Behavior of tricalcium phosphate and hidroxyapatite granules in sheep bone defects. Biomaterials.1990; 11: 513-7.

Comentarios

- Dania Ledesma (28/05/2007 4:53:46)

Excelente trabajo.
Felicitaciones y gracias por compartir su experiencia.