ANALISIS HISTOQUIMICO DE LA EXPRESIÓN DE ACIDO HIALURONICO EN CARCINOMAS DUCTALES "IN SITU" E INFILTRANTES DE MAMA

María Daniela Corte Torres^[1], Luis Ovidio González Vázquez^[1], Maya Vega Delgado^[1], Iván Pidal^[1], Francisco José Vizoso Piñeiro^[1]
(1) Fundación Hospital de Jove de Gijón ESPAÑA

Resumen

El ácido hialurónico es un glicosaminoglicano de alto peso molecular que parece tener un papel en el crecimiento y progresión de diferentes tumores malignos como demuestra la literatura.

En este trabajo evaluamos la expresión de la molécula en el carcinoma ductal in situ (CDIS), CDIS con microinfiltración y carcinoma ductal infiltrante de mama. Asimismo comparamos los valores de ácido hialurónico obtenidos por técnicas inmunoradiométricas (IRMA) con aquellos obtenidos por técnicas histoquímicas en el carcinoma ductal infiltrante.

Material y métodos:

La expresión de ácido hialurónico fue evaluada por técnicas histoquímicas en 45 casos de CDIS puro, 8 casos de CDIS con microinfiltración y 36 casos de carcinoma ductal infiltrante de mama, analizándose el área teñida mediante software específico. Igualmente, se realizó determinación de los niveles citosólicos de ácido hialurónico por técnicas inmunoradiométricas en los casos de carcinoma ductal infiltrante.

Resultados:

Nuestros resultados muestran que existe una significativa mayor expresión de ácido hialurónico en los casos de carcinoma ductal infiltrante de mama   y en los casos de CDIS con microinfiltración con respecto a los casos de CDIS (p<0.001). No hubo correlación significativa entre los valores de ácido hialurónico obtenidos por histoquímica y los obtenidos por técnicas de IRMA en los carcinomas ductales infiltrantes de mama.

Conclusiones:

Nuestros resultados indican una elevada expresión de ácido hialurónico por parte de los CDIS con microinfiltración lo cual sugiere una posible actuación de este glucosaminoglicano en las fases iniciales de la invasión de los carcinomas mamarios, donde podría jugar un importante papel en determinar el fenotipo migratorio de las células cancerosas. De todos modos , en tumores invasivos de mayor tamaño parece haber un intrincado balance entre la síntesis y la degradación de ácido hialurónico, condicionando una heterogeneidad intratumoral en el metabolismo del ácido hialurónico. 

Introduccion    

El ácido halurónico es un polisacárido ácido de alto peso molecular que es encontrado en la superficie celular y en la matriz extracelular de la mayor parte de los tejidos humanos ^{1, 2}. Es sintetizado a nivel de la membrana citoplasmática por el enzima hyaluronan sintetasa y posteriormente es expulsado a la matriz extracelular ¹. Su expresión se ve incrementada durante la remodelación fisiológica del tejido y en fenómenos de cicatrización [3], Como componente de la matriz extracelular interviene en varios procesos fisiológicos como la regulación del crecimiento capilar, el reconocimiento y la migración celular ². Por otra parte, elevadas concentraciones de la molécula se han encontrado en diferentes tumores humanos ^3-9, incluyendo el carcinoma de mama ^10-14. Estudios experimentales demuestran que el incremento en las concentraciones de ácido hialurónico estimula la motilidad celular ¹⁵, la adhesión celular ¹⁶, la neovascularización ¹⁷ y el desarrollo de metastasis ¹⁸, en neoplasias. Las células se unen al ácido hialurónico a través de, al menos, dos receptores de superficie, CD44 y el mediador de la motilidad del ácido hialurónico (RHAMM) ¹⁹.

    Existe poca información sobre la significación clínica del ácido hialurónico en el cáncer de mama. Sólo dos estudios han demostrado por métodos inmunohistoquímicos que la expresión elevada de ácido hialurónico está asociada con parámetros clínico-patológicos indicativos de agresividad tumoral como es la positividad de ganglios linfáticos y el alto grado tumoral  ^{13, 20, 21}, así como un corto tiempo de supervivencia en las ¹³.  De todos modos, en el único trabajo que analiza los niveles de ácido hialurónico por IRMA , encontramos una significativa mayor expresión de ácido hialurónico en los carcinomas de tipo ductal o lobulillar con respecto a los otros tipos histológicos. Además, en el subgrupo de pacientes con carcinoma ductal infiltrante, encontramos una relación positiva y significativa entre los niveles intratumorales de ácido hialurónico y parámetros indicativos de menor agresividad tumoral como buena diferenciación tumoral,  euploidia y positividad para los RE y RP. Igualmente encontramos que altos niveles de expresión de ácido hialurónico estuvieron significativamente asociados con mayor tiempo libre de enfermedad en el subgrupo de pacientes con carcinoma ductal infiltrante ²².

Material y Métodos    

Se obtuvieron bloques tisulares de 42 pacientes con CDIS puro,  de 8  pacientes con CDIS  con componente microinvasivo,  y de  32  pacientes con carcinoma ductal infiltrante.  Todos los pacientes fueron intervenidos quirúrgicamente en la Fundación Hospital de Jove de Gijón entre los años  1995 y 2005.

Los pacientes con CDIS fueron revisados y reclasificados de acuerdo a la Conferencia de Consenso de 1997  ²³.

Los pacientes con carcinoma invasivo no presentaban metástasis a distancia en el momento de la cirugía y fueron sometidas a mastectomía radical o bien a cirugía conservadora de la mama con disección axilar. Ninguna de ellas había recibido terapia neoadyuvante ni presentaba otros tumores malignos en el momento del diagnóstico. El grado histológico fue determinado siguiendo la modificación de Nottingham de los criterios de Bloom y Richardson ²⁴ .

Procesado del tejido y determinación por técnicas de IRMA

Las muestras obtenidas en fresco de los 32 pacientes con carcinoma ductal infiltrante fueron pulverizadas con un microdismembrador (BRAUN) a  –70ºC  y homogeneizadas in RIS-HCl (10 mM of TRIS, 1.5 mM of EDTA, 10% glycerol, 0.1% of monotioglycerol).

El ácido hialurónico fue medido a nivel citosólico usando una reacción con una proteína de unión específica (HBAP) mediante técnicas comerciales  (Pharmacia AB, Sweden). 

La radioactividad encontrada en las partículas es medida en una gamma cámara y la respuesta es inversamente proporcional a la concentración de ácido hialurónico en la muestra. La sensibilidad del método fue de 1 nanogramo por milillitro. El contenido de proteina fue cuantificado siguiendo el método de Bradford.

Determinación por técnica histoquímica

 Se analizó la expresión de ácido hialurónico por histoquímica en los 32 carcinomas ductales infiltrantes del presente estudio. La determinación se realizó por el método biotina-avidina (Dako, Dinamarca) para lo cual se utilizó una proteína de unión al ácido hialurónico de cartílago bovino biotinilada (Calbiochem).

Cada uno de los bloques de tejido se cortaron a 5 µ con la ayuda de un microtomo automatizado y posteriormente desparafinados en estufa a 60º C durante toda la noche. A con tinuación se sumergieron en xilol y se rehidrataron en alcoholes decrecientes hasta el agua destilada. El proceso de tinción se realizó con un sistema horizontal automatizado (Autostainer, Dako, Dinamarca) a temperatura ambiente.

Tras la tinción y deshidratación de las muestras se montaron en medio permanente (Entellan, Merck, Alemania).

Resultados    

La expresión de Acido Hialurónico fue evaluada por técnicas histoquímicas en 42 casos de CDIS puros, en 8 casos de  CDIS  con microinvasión, y en 32 casos de carcinoma ductal infiltrante de la mama. La tinción positiva para Acido Hialurónico se localizó en el estroma adyacente al CDIS y en el estroma intratumoral y/o peritumoral en los carcinomas invasivos .

 Nuestros resultados muestran unos valores de expresión de Acido Hialurónico significativamente más altos en carcinomas ductales infiltrantes (mediana:41,5 intervalo: 8-69,2) o en CDIS con microinvasión (mediana:52,9 intervalo: 16-62,8) con respecto al CDIS puro (mediana:14 intervalo: 1-44) (p=0,003 y p<0,001 respectivmente). Las características clinico-patológicas evaluadas en el CDIS incluyeron la edad y estado menopáusico de las pacientes, así como el subtipo arquitectural y el grado histólógico de acuerdo a la clasificación de Van Nuys,  expresión de Receptores de Estrógenos y Progesterona; mientras que en los carcinomas ductales infiltrantes se evaluó la relación entre caracteristicas clinicopatologicas de las pacientes tales como la edad, el estado menopausico, tamaño tumoral, afectación de ganglios linfáticos, el tipo histológico, el grado histológico y la expresión de los Receptores de Estrógenos y Progesterona. No hubo asociación significativa entre la expresión histoquímica de AH y  todos estos parámetros clinicopatológicos  en el CDISntre la expresión de ácido hialuronico y la edad de las pacientes y el tipo histologico de los tumores.

Los niveles citosólicos de de AH fueron examinados por radioinmunoensayo en todos los pacientes con carcinoma ductal infiltrante de mama existiendo una amplia variabilidad (intervalo: 256-44636 ng/mg de proteína, mediana: 4068 ng/mg de proteína).     

Nosotros también analizamos la posible correlación entre los valores de AH por ambos métodos (Histoquímica e IRMA) en carcinomas ductales infiltrantes sin que se observe una correlación significativa entre los resultados de ambas técnicas.   

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Figura1 -

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figura2 -

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Figura3 -

Discusión    

El presente estudio demuestra la expresion de AH varia en las diferentes fases de la progresion tumoral en el cáncer de mama primario. Mediante la determinación histoquímica del AH nosotros pudimos comprobar que dicho glicosaminoglicano se localiza en el estroma que rodea a las células malignas del componente microinvasivo de los CDIS, mientras que en los CDIS se localiza adyacente a la membrana basal siendo debilmente positivos.

La elevada expresion de AH en el componente microinvasivo de los CDIS puede ser debido a la mayor interaccion de las células epiteliales malignas con los componentes del estroma; aunque el AH es uno de los principales componentes del estroma y es conocido que su sintesis es estimulada por la interacción entre las células tumorales y del estroma ^{25, 26}. El incremento en la expresión de AH puede ser uno de los primeros pasos en la invasion tumoral, de hecho recientes estudios experimentales suguieren que las sintetasas de AH puede tener un papel importante en la iniciación y progresión del cáncer de mama ^{27, 28}

Este trabajo, a nuestro entender constituye el primer estudio clínico en el que se correlaciona la concentracion de AH determinada por IRMA con los valores de tinción de la determinación histoquímica del glicosaminoglicano. Existió una amplia variabilidad tanto en los niveles citosólicos como en la tinción histoquímica del AH en los carcinomas de mama  invasivos de mayor tamaño, lo cual se ha visto que se corresponde con la heterogeneidad biológica de estos tumores, pero no existio una correlación significativa entre los valores de AH obtenidos por ambas técnicas, lo cual puede ser debido a la heterogeneidad intratumoral de la expresion de AH  en el cáncer de mama y a varios aspectos relacionados con las distintas técnicas empleadas en la determinación del AH. Estudios histoquímicos han reportado la expresión de AH asociada con un peor pronóstico en algunos grupos de pacientes con carcinomas de mama, ^{11, 29} mientras que niveles elevados de AH determinados por IRMA han sido asociados con una elevada concentracion de RE y RP asi como con un pronóstico favorable en pacientes con carcinoma de mama invasivo ²². Asi mismo, Kosunen et al. demuestran que una baja expresion de AH constituye un fuerte indicador de corta supervivencia en pacientes con carcinoma de células escamosas ³⁰. Aunque las discrepancias entre los estudios puedan ser mas aparentes que reales, es posible que cuanto mas invasor sea el tumor, este tenga menos  AH, debido a una mayor degradación producto de la acción de las hialuronidasas y otras enzimas proteoliticas. Tambien es posible que tumores de mama con RE positivos y/o Rp negativos sean menos invasivos  y en estos la degradación del AH sea menor

Conclusiones    

Nuestros resultados indican una elevada expresión de ácido hialurónico por parte de los CDIS con microinfiltración lo cual sugiere una posible actuación de este glucosaminoglicano en las fases iniciales de la invasión de los carcinomas mamarios, donde podría jugar un importante papel en determinar el fenotipo migratorio de las células cancerosas. De todos modos , en tumores invasivos de mayor tamaño parece haber un intrincado balance entre la síntesis y la degradación de ácido hialurónico, condicionando una heterogeneidad intratumoral en el metabolismo del ácido hialurónico. 

Bibliografía    

1. Prehm P. Hyaluronate is synthesized at plasma membranes. Biochem J. 1984; 220;597-600.

2. Fraser JR, Laurent TC and Laurent UB. Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover. J Intern Med. 1997; 242;27-33.

3. Arai H, Kang KY, Sato H, et al. Significance of the quantification and demonstration of hyaluronic acid in tissue specimens for the diagnosis of pleural mesothelioma. Am Rev Respir Dis. 1979; 120;529-532.

4. Hopwood JJ and Dorfman A. Glycosaminoglycan synthesis by Wilms' tumor. Pediatr Res. 1978; 12;52-56.

5. Wang C, Tammi M, Guo H and Tammi R. Hyaluronan distribution in the normal epithelium of esophagus, stomach, and colon and their cancers. Am J Pathol. 1996; 148;1861-1869.

6. Sowa M, Kato Y, Nishimura M, Yoshino H, Kubo T and Umeyama K. Clinico-histochemical studies on type 4 carcinoma of the stomach--with special reference to mucopolysaccharides and sialic acid in tumor tissue. Jpn J Surg. 1989; 19;153-162.

7. Setala LP, Tammi MI, Tammi RH, et al. Hyaluronan expression in gastric cancer cells is associated with local and nodal spread and reduced survival rate. Br J Cancer. 1999; 79;1133-1138.

8. Llaneza A, Vizoso F, Rodriguez JC, et al. Hyaluronic acid as prognostic marker in resectable colorectal cancer. Br J Surg. 2000; 87;1690-1696.

9. Vizoso FJ, del Casar JM, Corte MD, et al. Significance of cytosolic hyaluronan levels in gastric cancer. Eur J Surg Oncol. 2004; 30;318-324.

10. Takeuchi J, Sobue M, Sato E, Shamoto M and Miura K. Variation in glycosaminoglycan components of breast tumors. Cancer Res. 1976; 36;2133-2139.

11. Bertrand P, Girard N, Delpech B, Duval C, d'Anjou J and Dauce JP. Hyaluronan (hyaluronic acid) and hyaluronectin in the extracellular matrix of human breast carcinomas: comparison between invasive and non-invasive areas. Int J Cancer. 1992; 52;1-6.

12. Ponting J, Howell A, Pye D and Kumar S. Prognostic relevance of serum hyaluronan levels in patients with breast cancer. Int J Cancer. 1992; 52;873-876.

13. Auvinen P, Tammi R, Parkkinen J, et al. Hyaluronan in peritumoral stroma and malignant cells associates with breast cancer spreading and predicts survival. Am J Pathol. 2000; 156;529-536.

14. de la Torre M, Wells AF, Bergh J and Lindgren A. Localization of hyaluronan in normal breast tissue, radial scar, and tubular breast carcinoma. Hum Pathol. 1993; 24;1294-1297.

15. Goebeler M, Kaufmann D, Brocker EB and Klein CE. Migration of highly aggressive melanoma cells on hyaluronic acid is associated with functional changes, increased turnover and shedding of CD44 receptors. J Cell Sci. 1996; 109 ( Pt 7);1957-1964.

16. Catterall JB, Jones LM and Turner GA. Membrane protein glycosylation and CD44 content in the adhesion of human ovarian cancer cells to hyaluronan. Clin Exp Metastasis. 1999; 17;583-591.

17. Rooney P, Kumar S, Ponting J and Wang M. The role of hyaluronan in tumour neovascularization (review). Int J Cancer. 1995; 60;632-636.

18. Zhang L, Underhill CB and Chen L. Hyaluronan on the surface of tumor cells is correlated with metastatic behavior. Cancer Res. 1995; 55;428-433.

19. Rudzki Z and Jothy S. CD44 and the adhesion of neoplastic cells. Mol Pathol. 1997; 50;57-71.

20. Auvinen PK, Parkkinen JJ, Johansson RT, et al. Expression of hyaluronan in benign and malignant breast lesions. Int J Cancer. 1997; 74;477-481.

21. Wernicke M, Pineiro LC, Caramutti D, et al. Breast cancer stromal myxoid changes are associated with tumor invasion and metastasis: a central role for hyaluronan. Mod Pathol. 2003; 16;99-107.

22. Corte MD, Gonzalez LO, Lamelas ML, et al. Expression and Clinical Signification of Cytosolic Hyaluronan Levels in Invasive Breast Cancer. Breast Cancer Res Treat. 2006;

23. Consensus conference on the classification of ductal carcinoma in situ. Hum Pathol. 1997; 28;1221-1225.

24. Bloom HJ and Richardson WW. Histological grading and prognosis in breast cancer; a study of 1409 cases of which 359 have been followed for 15 years. Br J Cancer. 1957; 11;359-377.

25. Knudson W, Biswas C and Toole BP. Interactions between human tumor cells and fibroblasts stimulate hyaluronate synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984; 81;6767-6771.

26. Brown CT, Applebaum E, Banwatt R and Trinkaus-Randall V. Synthesis of stromal glycosaminoglycans in response to injury. J Cell Biochem. 1995; 59;57-68.

27. Udabage L, Brownlee GR, Waltham M, et al. Antisense-mediated suppression of hyaluronan synthase 2 inhibits the tumorigenesis and progression of breast cancer. Cancer Res. 2005; 65;6139-6150.

28. Udabage L, Brownlee GR, Nilsson SK and Brown TJ. The over-expression of HAS2, Hyal-2 and CD44 is implicated in the invasiveness of breast cancer. Exp Cell Res. 2005; 310;205-217.

29. Silverstein MJ, Poller DN, Waisman JR, et al. Prognostic classification of breast ductal carcinoma-in-situ. Lancet. 1995; 345;1154-1157.

30. Kosunen A, Ropponen K, Kellokoski J, et al. Reduced expression of hyaluronan is a strong indicator of poor survival in oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol. 2004; 40;257-263.

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