9º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

Nº 604. Comunicación libre

Direccion de contacto
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Morfometria celular e vascular em tecido de granulação em modelo de angiogênese inflamatória por implantação de esponja de polyether-polyurethane em camundongos

Anilton Cesar Vasconcelos^[1], Paula Peixoto Campos^[1], Monica Alves Diniz Ferreira^[1], Silvia Andrade Passos^[2]
(1) Departamento de Patologia Geral Instituto de Ciências Biológicas da UFMG Caixa Postal 2486 - 31270-010 – Belo Horizonte, MG. BRASIL BRASIL
(2) Departamento de Fisiologia e Biofisica Instituto de Ciências Biológicas da UFMG Caixa Postal 2486 - 31270-010 – Belo Horizonte, MG BRASIL BRASIL

Resumen

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de polyether-polyurethane foram implantadas na região dorsal de 4 grupos de 7 camundongos e retiradas 4, 7, 10 e 14 dias após a implantação. A seguir foram processadas e examinadas morfométrica e bioquimicamente. Quantificaram-se os índices apoptóticos (TUNEL) e de ativação celular (AgNORs), além das atividades de mieloperoxidade (MPO) e os N-acetil-beta-glucosaminidase (NAG) como índices de inflamação - polimorfonucleares e macrófagos) e o teor de Hemoglobina (índice de vascularização). Observou-se infiltração gradativa de tecido fibrovascular constituído de diferentes tipos celulares e de colágeno frouxo e denso (mais abundante). O número elevado de neutrófilos nos períodos iniciais foi acompanhado da infiltração gradativa de macrófagos, fibroblastos e células endoteliais. A atividade celular, medida pelo índice de AgNORs foi maior até os 10 dias, diminuindo aos 14. As atividades de MPO e da NAG aumentaram progressivamente sugerindo que os polimorfonucleares e os macrófagos estavam ativos. A angiogênese foi intensa, inicialmente com maior número de vasos com área pequena. Aos 14 dias o número de vasos era menor e a área maior, indicando maior fluxo e função. O teor de Hemoglobina na esponja cresceu progressivamente, indicando crescente diferenciação e função vascular ao longo do tempo. A apoptose ocorreu mais intensamente aos 4 dias, menos intensamente aos 7, mantendo-se baixa entre 10 e 14 dias. Pôde-se concluir que as diversas populações celulares se alteram durante diferentes momentos da inflamação e reparação alternando processos de proliferação e ativação celular com apoptose.

    Quando um tecido animal é agredido ele responde à agressão defendendo-se. Um dos mecanismos de defesa dos tecidos é a inflamação. A inflamação é uma complexa reação dos tecidos vascularizados do organismo expressando resposta à agressão. É de suma importância que o organismo responda à injúria eliminando sua fonte, bem como reparando os danos teciduais (CLARK, 1996).
    Por ser uma reação complexa ela apresenta diferentes etapas ou momentos funcionais. Inicialmente, o agente agressor induz a liberação de mediadores químicos pelo tecido e estes são responsáveis pelos fenômenos subsequentes da inflamação. Os mediadores causam alterações hemodinâmicas como vasodilatação com aumento do fluxo sanguíneo para o local da agressão e aumento da permeabilidade vascular. Vasos mais permeáveis permitirão a saída de líquido e células de defesa para o tecido. Tais células migram para o foco da lesão através do mecanismo de quimiotaxia para resolver a agressão. As células inflamatórias emitem sinais que iniciam e regulam o reparo do tecido lesado formando o tecido de granulação. Leucócitos ativados produzem mieloperoxidade (MPO) e os macrófagos N-acetil-beta-glucosaminidase (NAG).     Os fibroblastos ativados iniciam a deposição de colágeno no local (GREENHALGH, 1998).
Os macrófagos liberam citocinas e fatores de crescimento que estimulam e atraem outros tipos celulares para o foco da lesão como os fibroblastos e células endoteliais. Estas células se proliferam e promovem a deposição de colágeno e a formação dos vasos sanguíneos que irão fornecer oxigênio e nutrientes para as células que migraram para o foco da lesão. Quando o agente agressor é eliminado inicia-se a fase de resolução da resposta inflamatória.
    O processo de reparação é dinâmico e altamente regulado envolvendo mediadores solúveis, elementos sanguíneos, matriz extracelular e células parenquimatosas. Vigorosa resposta angiogênica é essencial para uma reparação tecidual normal, pois além de prover nutrientes e células inflamatórias para o tecido lesado, os novos vasos sangüíneos facilitam a remoção de material residual e auxiliam no desenvolvimento do tecido de granulação (NISSEN et al., 1998).
    Este novo tecido que se forma no foco da lesão para resolvê-la é chamado de tecido de granulação. A formação e maturação do tecido de granulação envolve uma sequência complexa de eventos que vão da proliferação à diferenciação e reabsorção de células (CLARK, 1996).
    A formação de novos vasos sanguíneos requer a ativação das células endoteliais, a degradação da membrana basal, migração e proliferação destas células. Assim, a interação entre células e matriz é importante (HORNEBECK et al., 2002). O colágeno do tipo I induz as células endoteliais a assumirem uma morfologia fusiforme e a se alinharem para formar sólidos cordões pré-capilares (DELVOS et al., 1982; MONTESANO et al., 1983; JACKSON et al., 1994; RICHARD et al., 1998; SWEENEY, 1998; WHELAN & SENGER, 2003).
    Durante a resolução da inflamação, todos os processos que ocorreram no tecido devem ser revertidos para que o tecido volte a sua arquitetura e funções normais. Células que já realizaram suas funções no foco inflamatório devem ser eliminadas para evitar a continuidade e amplificação do processo inflamatório. Já as células que migraram e proliferaram no foco da lesão devem deixar o local para o tecido voltar as funções normais, sem suscitar mais resposta inflamatória. O mecanismo responsável pela morte celular silenciosa é a apoptose. Células lábeis e estáveis precisam ser eliminadas. Evidências recentes sugerem que a diminuição da celularidade no processo de maturação do tecido de granulação se associa à ocorrência de apoptose (DEMOULIERE et al., 1995; BROWN et al., 1997; GREENHALGH, 1998). A apoptose ou morte celular programada é um tipo de morte celular caracterizado por profundas modificações estruturais e funcionais (WYLLE, 1992). Trata-se de um mecanismo fisiológico de controle da população celular que regula o tamanho dos tecidos, exercendo um papel oposto ao da mitose (VASCONCELOS, 1995).
    O implante de esponjas representa um modelo in vivo para a análise de respostas celulares como a angiogênese e fibrogênese que ocorrem durante o reparo de feridas (FAJARDO et al., 1988; DAVIDSON et al., 1985; ANDRADE et al., 1997; SEPHEL et al., 1996). A inserção subcutânea de matrizes esponjosas permite a infiltração de várias células de reparo das camadas dérmicas e tem sido utilizada para estudar fatores pró e anti-angiogênicos, assim como alterações na celularidade e na matriz extracelular envolvidas neste processo em animais experimentais (ANDRADE et al., 1992; MAJIMA et al., 2000).
    A reação à inserção da esponja é semelhante à resposta do organismo a um corpo estranho. A resposta inflamatória gerada induz um processo de reparo que envolve ativação, migração, proliferação, diferenciação e renovação coordenada de diversos tipos celulares (NISSEN et al., 1998).
    Diante do exposto, este trabalho teve como objetivos estudar a cinética da formação do tecido fibrovascular que infiltra a esponja. A melhor compreensão da cinética da evolução do processo da angiogênese inflamatória poderá resultar em novas abordagens terapêuticas e intervenções visando acelerar cicatrizações deficitárias, ou prevenir excessiva proliferação celular nos processos de reparo dos tecidos.
Para se estudar esta cinética alguns parâmetros foram avaliados, tais como: (a) o recrutamento celular, através da quantificação dos diferentes tipos celulares (leucócitos, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais); (b) a determinação de alguns produtos que denotam a diferenciação destas células (MPO, NAG, colágeno e vasos), (c) a proliferação celular (expressão de AgNORs); e (d) a apoptose (reação de TUNEL) durante a formação do tecido de granulação in vivo utilizando o implante de esponjas. De acordo com a literatura consultada, este é o primeiro estudo a enfocar simultaneamente estes eventos biológicos na formação e maturação do tecido de granulação.

Animais utilizados e implantação da matriz esponjosa
    Os experimentos de caracterização do processo de angiogênese inflamatória foram realizados utilizando 65 camundongos BALB/c machos de 4 a 5 semanas, pesando aproximadamente 20 gramas, provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências Biológicas-UFMG.
    Durante o período experimental todos os animais foram mantidos em gaiolas individuais com livre acesso à água e ração.
    Discos de esponjas de poliéster poliuretano (Vtafoam Ltd) de 8mm de diâmetro por 5 mm de espessura, canulados centralmente com sondas de polivinil (PE 20 – Bio Vida) de 12 mm de comprimento, foram devidamente confeccionados e mantidos em álcool 70% durante, pelo menos, 24 horas antes da implantação. Para o procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados com Tribromo Etanol (Sigma) 2,5% (i.p.), 1mL/100g e submetidos à tricotomia e à assepsia da região dorsal. Em seguida, foi feita uma incisão de aproximadamente 1cm na pele de tal região e, após delicada divulsão do tecido subcutâneo, foi introduzido o disco de esponja, previamente lavado em água destilada e submetido à fervura durante 10 minutos. A cânula foi exteriorizada através de um orifício na pele da região cervical, suturada junto à pele e sua extremidade superior ocluída com massa de modelagem. Finalmente, a incisão dorsal foi suturada. Após a cirurgia, os animais foram mantidos sob aquecimento artificial até completo restabelecimento de suas funções vitais.

Processamento histológico e colorações
    Os implantes foram fixados em formol tamponado neutro a 10% por no mínimo 48 horas e processados rotineiramente para inclusão em parafina. As secções de 5um obtidas foram coradas em diferentes métodos: hematoxilina-eosina (HE) e Shorr (para detalhamento morfocitológico), AgNOR (Impregnação pela prata para identificação e quantificação das regiões organizadoras de nucléolos), Picrosirius (para evidenciação histológica e morfometria do processo de colagenização) (LUNA, 1968) e reação de TUNEL (para detecção in situ da fragmentação do genoma, na apoptose) (GAVRIELI et al., 1992).

Parâmetros e estratégia morfométrica
    De cada uma das lâminas estudadas, analisou-se o padrão de infiltração do tecido fibrovascular, o tipo celular (leucócitos, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais), a expressão das AgNORs como marcador de ativação (leucócitos polimorfonucleares e macrófagos) e proliferação celular (fibroblastos e células endoteliais), o número e área de vasos, a área ocupada por colágeno e, por fim, a identificação in situ da fragmentação do genoma como marcador de apoptose (Reação de TUNEL).
    Em cada campo microscópico estudado a abordagem citomorfométrica utilizada referiu-se à porcentagem de células quantificadas (conforme o tipo celular ou a marcação) em relação às células totais. Além disto, em cada campo microscópico quantificou-se o número e área de vasos e obteve-se também a área média destes. A área ocupada por colágeno na esponja nos diversos momentos foi obtida a partir da captura, binarização das imagens e densitometria de todos os campos da esponja.
    A quantificação das células por tipo (polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais) ou por marcação (AgNORs e TUNEL) e totais de cada campo foi feita a partir de imagens digitalizadas obtidas de amostras dos campos histológicos em microscópio de luz com objetiva planacromática de 100 vezes. A quantificação do número e área de vasos, assim como a da área ocupada por colágeno em cada campo foi feita a partir de imagens digitalizadas obtidas dos campos histológicos em microscópio de luz com objetiva planacromática de 40 vezes.
    O número mínimo representativo de campos microscópicos para a quantificação da marcação (AgNORs e TUNEL) e do número de vasos foi determinado a partir da contagem inicial em 50 a 100 campos tomados aleatoriamente de uma secção de esponja (MORO et al., 2004). Desses, formaram-se 10 subamostras com número crescente de campos (5, 10, 15... até 50) retirados aleatoriamente com reposição. De cada grupo, calculou-se a média aritmética e respectivo desvio Padrão (DP) para cada tamanho amostral. À medida que o tamanho da amostra aumenta, os DPs tendem a diminuir até se estabilizar. Assim, quando o incremento do número de campos não resulta em redução considerável no valor do coeficiente de variação considera-se que o tamanho daquela amostra como mínimo representativo (SAMPAIO, 1998) (Gráfico 1).
    As imagens foram digitalizadas em microcamera (JVC TK-1270/JGB) e transferidas para o analisador de imagens (Kontron Elektronics, Carl Zeiss - KS300 versão 2.0). (CALIARI, 1997).

Migração, ativação e proliferação celular
    Vinte imagens (obtidas de 20 campos distintos) com ampliação final de 1000X (correspondendo a uma área de 8.533,37 um²/campo) foram digitalizadas de cada uma das lâminas coradas pela técnica de AgNOR de 7 animais em cada um dos 4 períodos avaliados. Quantificaram-se as AgNORs presentes em cada núcleo de cada célula presente no campo histológico, paralelamente, o número de núcleos marcados e totais de cada campo.
    A contagem de AgNORs nos diferentes tipos celulares foi realizada considerando-se o tamanho, forma e localização de seus diversos núcleos na matriz esponjosa. Assim, núcleos segmentados ou lobulados de 7-8 um foram considerados de polimorfonucleares; núcleos maiores e vesiculosos com 10 a 11um foram considerados de macrófagos; núcleos fusiformes dispostos na matriz próximos às fibras colágenas foram considerados como de fibroblastos e núcleos fusiformes delimitando luz de vasos nas proximidades de hemácias foram quantificados como de células endoteliais.
    Um parâmetro morfométrico utilizado foi a média da expressão de AgNORs nos núcleos dos diferentes tipos celulares estudados por campo microscópico e foi obtido conforme a seguinte equação:
        Média de AgNOR = Somatório do nº de AgNORs / Somatório do nº de células marcadas.
    Outra abordagem morfométrica utilizada foi o índice de marcação de AgNOR (IAgNOR) e referiu-se à proporção das células que expressam AgNOR acima da média em relação ao número total de células por campo microscópico. Este índice foi obtido conforme a seguinte equação:
Indice de AgNOR = Soma do nº de células marcadas acima da média / Soma do nº de células marcadas x 100.
    Paralelamente, nas seções coradas em H.E. a área invadida pelo tecido fibrovascular foi obtida a partir da captura das imagens com ampliação de lupa, com posterior delimitação e quantificação como descrito por KYRIAKIDES (2001). A proporção entre a área de tecido fibrovascular infiltrante e a área total da esponja foi obtida como descrito por SAUDON & REED (2003).

Produtos celulares
    Para a avaliação da ativação e celularidade nos implantes, foram utilizados tanto procedimentos histomorfométricos quanto bioquímicos. O influxo de neutrófilos e de macrófagos foi avaliado diretamente pela quantificação histomorfométrica destas células no tecido de infiltração e indiretamente através da quantificação da atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e N- acetilglicosaminidase (NAG) respectivamente. Além disso, os fibroblastos foram quantificados morfometricamente, assim como o colágeno produzido por estas células em diferenciação. Os índices de vascularização dos implantes foram obtidos pela quantificação de células endoteliais e pela análise histomorfométrica dos vasos que incluiu o número de vasos, a área dos mesmos. Além disso, quantificou-se o conteúdo de hemoglobina na esponja como forma de estimar o fluxo sanguíneo nos vasos, característica de vasos maduros.

    Atividade da mieloperoxidade (MPO)
    A atividade de MPO foi mensurada em todo o tecido da esponja como descrito anteriormente (BAILEY, 1988; SOUZA et al., 2000). Cada implante foi homogeneizado (Tekmar TR-10, OH, U.S.A) em 2 ml de reagente de Drabkin (Labtest, São Paulo, Brazil) e centrifugada à 10,000 x g por 15 min. Após o processamento do sobrenadante do implante de esponja para a determinação da Hb (ver abaixo), uma parte do pellet correspondente foi homogeneizada em tampão 4.7 (0,1 M NaCl, 0,02 M Na₃PO₄, 0,015 M de NaEDTA) e centrifugada à 12,000 xg durante 20 min. Os pelletes foram ressuspendidos em rampão de fosfato de sódio 0.05 M (pH 5,4) contendo 0,5% de hexa-1,6-bisdecyltrimethylammonium bromide (HTAB, Sigma). A suspensão foi congelada e descongelada 3 vezes utilizando nitrogênio líquido e finalmente centrifugadas em 10,000x g durante 10 min. A atividade da MPO no sobrenadante resultante foi mensurada pela mistura de 25 ul de 3,3’-5,5’-tetrametibenzidina (TMB, Sigma), preparado em dimetil sulfoxido (DMSO, Merck) em uma concentração de 1,6 mM com 100 ul H₂O₂, dissolvida em tampão fosfato (pH 5,4) contendo 0,5% HTAB em uma concentração final de 0,003% vv-1) e 25ul do sobrenadante da amostra do tecido processada. O ensaio foi realizado em uma 96-wel microplate e foi iniciado pela incubação do sobrenadante da amostra em solução de TMB por 5 min à 37^oC. Então a H₂O₂ foi adicionada e a incubação continuou por outros 5 min. A reação terminou com a adição de 100ul de H₂SO₄ e foi quantificada colorimetricamente à 450 nm em um espectrofotômetro (E max- Molecular Devices). Os resultados foram expressos como densidade óptica (OD) por g de tecido úmido (implante).

    Atividade da N-acetil-beta-glucosaminidase (NAG)
    A enzima lisossômica N-acetil-beta-glucosaminidase se encontra presente em macrófagos ativos (BAILEY, 1988). Parte do pellet remanescente após a dosagem de Hb foi utilizada para este ensaio visando detectar os níveis dessa enzima. Estes pellets foram homogeneizados em uma solução de NaCl (0,9% wv-1) contendo 0,1%v v-1 Triton X-100 (Promega) e centrifugado (3000 x g; 10min 4^o C). Amostras do sobrenadante resultante (100ul) foram incubadas por 10 min com 100ul p-nitropenyl-N-acetyl-beta-glucosaminide (Sigma), preparado em tampão de citrato/fosfato ((pH 4,5) em uma concentração final de 2.24 mM. A reação foi terminada pela adição de 100ul 0,2 M tampão glycine pH 10.6. A hidrolise do substrato foi determinada pela mensuração da absorção em 405 nm. A atividade foi expressa como densidade óptica (OD) por g de tecido molhado (implante).

    Quantificação do colágeno
    Para a quantificação de colágeno utilizou-se o Picrosirius Red (PSR), um composto aniônico que distingue a espessura e densidade das fibras colágenas pela coloração emitida sob a luz polarizada. Enquanto as fibras finas dissociadas são esverdeadas, as fibras mais grossas fortemente associadas emitem cores com comprimento de ondas maiores, como vermelho e amarelo (KESLER et al., 2000). Lâminas coradas em picrossirius foram estudadas com objetiva de 10 X para a quantificação das áreas de colágeno. De cada lâmina foram obtidas 20 imagens em áreas de maior concentração de fibras colágenas. A densidade dos “pixels” das regiões ocupadas pelas fibras colágenas foram selecionados na imagem real para subsequente criação de uma imagem binária, visando a quantificação densitométrica. A metodologia empregada para captura, segmentação de imagens, definição das condições morfométricas e obtenção das medidas foi descrita por CALIARI (1997).

    Análise morfométrica dos vasos sanguíneos
    Para a análise dos vasos sanguíneos utilizou-se a coloração pelo Shorr. Contaram-se 15 campos por lâmina e analisou-se o perfil dos vasos sanguíneos no modelo de esponja através da quantificação do número de vasos e da área media desses vasos que apresentavam ou não hemácias em seu interior.

    Quantificação de Hemoglobina na esponja
    O conteúdo de hemoglobina (Hb) detectada na esponja utilizando-se o método de Drabkin (DRABKIN & AUSTIN, 1932) foi utilizado como forma de avaliar o fluxo sanguíneo nos vasos, característica de vasos diferenciados. Este método foi modificado e utilizado para determinar a angiogênese em vários modelos e tecidos, incluindo o modelo de esponja (PASSANITI et al., 1992; HU et al., 1995; LAGE & ANDRADE, 2000). Cada implante foi homogeneizado (Tekmar TR-10, OH, U.S.A) em 2 ml de reagente de Drabkin (Labtest, São Paulo, Brazil) e centrifugada à 10,000 x g por 15 min. Os sobrenadantes foram filtrados através de um filtro de 0,22um (Milipore). A Hb nas amostras foi determinada espectrofotometricalmente pela medida da absorbância em 540nm utilizando uma placa de leitor de ELISA e comparada com uma curva padrão de Hb. O conteúdo de Hb no tecido de granulação foi expressa como ug por mg de tecido úmido.

     Identificação e quantificação da apoptose
    Utilizou-se a técnica de TUNEL para marcar as células em apoptose e a morfometria para a quantificação das mesmas, considerando-se ainda a morfologia sugestiva de apoptose (VASCONCELOS, 2001). Os corpos apoptóticos quando inúmeros e próximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma única célula em apoptose. Quando distantes entre si, foram considerados como resultado de apoptose em células diferentes e contabilizados como tal.
    A técnica de TUNEL para a marcação “in situ” da fragmentação do genoma combina princípios histoquímicos e imuno-histoquímicos e é aplicada em corte de tecido embebido em parafina identificando células apoptóticas. Requer o uso de uma enzima exógena, a transferase terminal de deoxinucleotídeo (TdT) que incorpora um nucleotídeo marcado na extremidade 3’0H do genoma em fragmentação. Os nucleotídeos marcados inseridos são posteriormente identificados como grumos GAVRIELI et al., 1992 amarronzados a partir da reação da diaminobenzidina (DAB) com a Peroxidase (POD). Utilizou-se o kit da Oncogene (TdT –FragEL TM) Dna Fragmentation Detection Kit.
    Cinquenta imagens (obtidas de 50 campos distintos) com ampliação final de 1000X (correspondendo a uma área de 8.533,37 um²/campo) foram digitalizadas de cada uma das lâminas coradas pela técnica de TUNEL de 7 animais em cada um dos 4 períodos avaliados. Quantificaram-se as células marcadas pela reação e com morfologia sugestiva presentes em cada campo. O parâmetro morfométrico utilizado - o índice de marcação de apoptose (IA) - referiu-se à proporção de células em apoptose em relação ao número total de células por campo microscópico e foi obtido conforme a seguinte equação:
        IA = Somatório do nº de células em apoptose / Somatório do nº de células totais x 100.

Análise Estatística
    Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão ou mediana, conforme tenham tido uma distribuição normal ou não, pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando a distribuição foi normal utilizou-se a análise de variância (ANOVA) para avaliar eventuais diferenças entre os parâmetros mensurados nos diferentes tempos de implante e aplicou-se o teste de Newnam Keuls para comparar os grupos entre si e quando comparou-se dois grupos utilizou-se o teste t .Quando a distribuição dos dados não demonstrou normalidade, o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis foi aplicado. Se os dados consistiam de mais de dois grupos, utilizou-se o teste de múltipla comparação de Dunn. Os valores de P<0,05 foram considerados significativos, utilizando-se o programa GraphPad Prism 3.0.

Graf1 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 1- Número mínimo representativo de campos para a quantificação de vasos">
Graf1 -

GRÁFICO 1- Número mínimo representativo de campos para a quantificação de vasos

Cinética da infiltração de diferentes tipos celulares na matriz esponjosa
    Inicialmente a esponja implantada é acelular. Com o tempo e o decorrer da resposta inflamatória, existe a predominância de vários tipos celulares nas diversas fases do processo. No tempo inicial de 4 dias observou-se um infiltrado celular composto predominantemente por leucócitos e macrófagos, gradativamente aos 7, 10 e 14 dias pós implantação houve aumento de todas as populações celulares.
    Os leucócitos e macrófagos foram as células predominantes nos diferentes tempos após o implante da esponja. Os fibroblastos apareceram em menor quantidade, seguidos pelas células endoteliais (GRAF. 2).
A análise estatística (ANOVA) mostrou que os leucócitos apareceram em menor quantidade no 4^o dia (108,40 +/- 9,91) pós-implantação quando comparados (P< 0,001) com os tempos de 7 (253,40 +/- 51,56), 10 (227,00 +/- 37,33) e 14 dias (323,40 +/- 25,56). Nestes intervalos de 7, 10 e 14 as quantidades de leucócitos não foram diferentes (P> 0,05).
    Da mesma maneira , no tempo de 4 dias após o implante da matriz esponjosa a quantidade de macrófagos quantificada (77,60 +/- 5,92) foi significativamente menor (P< 0,001) quando comparada com os tempos de implante de 7 (157,20 +/- 20,87), 10 (240,40 +/- 17,76) e 14 dias (231,80 +/- 26,05). No tempo de 7 dias esta população celular também foi menor (P< 0,05) que nos tempos de 10 e 14 dias. Quando se comparou o tempo de 10 com o de 14 dias não houve diferença na população de macrófagos infiltrantes.
A população de fibroblastos foi menor (P< 0,001) no tempo de 4 dias (6,80 +/- 1,28) quando comparado com os tempos de 7 (64,40 +/- 8,25), 10 (75,60 +/- 6,44) e 14 (115,00 +/- 7,47) dias após a implantação. Nos tempos de 7 e 10 dias após a implantação da esponja, a população de fibroblastos foi semelhante, sendo menor que a obtida com o tempo de 14 dias (P<0,001).
    As células endoteliais não foram detectadas no 4^o dia após a implantação da esponja, só sendo quantificadas a partir do 7^o dia (68,40 +/- 15,28) quando foi semelhante ao obtido para o 10^o (94,40 +/- 19,03) dia. A quantidade de células endoteliais observadas aos 14 dias (131,40 +/- 12,93) foi significativamente maior (P<0,05) que a obtida para 7 dias, mas similar à observada para 10 dias.

Cinética da migração, ativação e proliferação celular
Morfologia das AgNORs
    Na impregnação pela prata as AgNORs foram identificadas como grumos marron escuros, com forma, tamanho e distribuição variadas. Os grumos eram isolados, ou agregados, com formas arredondadas ou irregulares, distribuídos difusamente no núcleo ou circundando o nucléolo, com aparência de rosário ou satélites. Os grumos resultantes da impregnação pela prata foram quantificados em diferentes tipos celulares presentes nos cortes histológicos (polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos e células endoteliais) (FIG.1).

Média de AgNORs por tipo celular
    A quantidade média das AgNORs nos núcleos dos leucócitos diferiu (P<0,05) entre os 4 períodos estudados, sendo maiores aos 10 dias (3,25+/-0,05) e 4 dias (2,91+/-0,06) e menores no 7^o (2,76+/-0,04) e 14^o (2,52+/-0,04) dias. (GRAF.3a).
    As AgNORs nos núcleos de macrófagos foram mais intensamente expressas no 10^o (4,34+/-0,06) dia. Semelhantes no 7^o(3,84+/-0,06) e 4^o (3,80+/-0,08) dias, e menores no 14^o(3,18+/-0,05) dia. (GRAF.3b).
As AgNORs expressas pelos fibroblastos nos dias 4 (3,91+/-0,36), 7 (3,35+/-0,09) e 10 (3,63+/-0,09) foram semelhantes e significativamente maiores do que as expressas no 14^o dia (2,98+/-0,06). (GRAF.3c).
    As células endoteliais expressaram maior quantidade de AgNORs no 10(3,6220,078) que no 7^o (3,44+/-0,09) dia e menor no 14^o dia (2,94+/-0,05). As AgNORs. não foram quantificadas no 4^o dia por não se visualizar nesse período as células endoteliais. (GRAF.3d).

Índice de Ativação celular (IAgNORs) por tempo pós implantação
    A ANOVA utilizada para avaliar o índice de ativação celular nos diferentes tempos do implante estudados revelou diferenças significativas entre os mesmos (P < 0.001).
    A ativação celular foi maior (P < 0.001) aos 10 dias (39,52 +/- 1,61) após a implantação da esponja. Aos 7 (33,66 +/- 1,290) e 4 (35,80 +/- 2,13) dias após a implantação não houve diferença significativa (p > 0,05) no índice de ativação celular. A ativação celular foi menor (P < 0.001) aos 14 (31,12 +/- 1,39) dias (P < 0.001). (GRÁF. 4).

Análise do tecido fibrovascular que infiltra a esponja
    A infiltração do tecido fibrovascular no implante ocorreu gradualmente de acordo com o decorrer do tempo pós implantação (FIG. 2).
    Com relação à infiltração do tecido fibrovascular; aos 4 dias após a implantação, observou-se que paralelamente à infiltração de células (polimorfonucleares, macrófagos e ocasionais fibroblastos) surgia uma fina e delicada matriz extracelular imatura (MEC) circundando as células. Aos 7 dias, já se observava a formação de uma malha mais organizada de matriz extracelular e invasão de vasos sanguíneos nos intersticios da esponja. Esta matriz intersticial era formada de fibras mais densas na margem da esponja e subdividida em fibras mais delgadas dentro da esponja . Aos 10 e 14 dias observou-se um tecido fibrovascular de granulação mais denso com vários vasos sanguíneos.
    A infiltração do tecido fibrovascular composto de células migrantes e proliferantes, fibras conjuntivas e vasos na esponja foi progressivo e evidente. A área ocupada pelo tecido fibrovascular aumentou progressivamente nos intervalos de avaliados (p < 0,001). No implante de 4 dias o tecido de infiltração foi considerado insignificante, composto predominantemente por células, não tendo sido observados vasos e fibras maduras (GRAF. 5).

Produtos celulares
Cinétida da atividade enzimática (MPO) e (NAG)
    Os leucócitos ativos presentes no implante liberaram mieloperoxidase e sua atividade foi quantificada como marcador de diferenciação e atividade para leucócitos-neutrófilos. A leitura da densidade óptica (OD) por g de tecido molhado (implante) mostrou atividade crescente de MPO, menor aos 4 dias (20,00 +/- 3,00), seguido pelo 7^o dia (24,46 +/- 3,5) e maior aos 10 (42,22 +/- 6,65) e 14 (44,52 +/- 5,67) dias após a implantação (GRAF. 6).
    Os macrófagos ativos presentes no implante liberaram NAG e sua atividade foi quantificada como marcador de diferenciação e atividade para estas celulas. A leitura da densidade óptica (OD) por g de tecido molhado (implante) mostrou atividade crescente de NAG, menor aos 4 dias (1,44 +/- 0,30) e maior aos 14 dias (10,91 +/- 0,93) após a implantação da esponja (GRAF. 7).

Cinética da produção de colágeno
    A avaliação densitométrica do colágeno denso, que forma fibras e fouxo mostrou diferenças com a evolução do tempo após o implante das esponjas. Enquanto o colágeno denso aumentou progressivamente nos implantes, o frouxo decresceu (GRAF. 8).
    A área ocupada por colágeno denso foi maior no 14 (19090 um²) dia após o implante da esponja seguido pelo 10 (7438 um²) e 7 (2440 um²)dia. Já a área ocupada por colágeno frouxo foi maior no 10o (143,80+/-5,2 um²) dia após a implantação que no 14^o(81,05 +/- 14,76 um²). No 7º dia as fibras do colágeno frouxo apresentavam-se muito dispersas impossibilitando sua avaliação densitométrica

Cinética da formação de vasos sanguíneos
Análise morfométricas dos vasos
    O número médio de vasos por campo histológico estudado foi maior aos 10 (15,00) e 7 (16,00) dias após o implante das esponjas, decaindo aos 14 (11,00) dias. A área média dos vasos no campo histológico no 10 (252,40 um²) e 14 (236,00 um²) dias foi maior que a área dos vasos no 7º (214,90 um²) dia (GRAF. 9)

Quantificação de hemoglobina na esponja (Índice vascular)
    O conteúdo de Hb no tecido de granulação presente na esponja foi considerado como parâmetro acessório para avaliar a neoformação vascular, característica de vasos diferenciados. Expresso como ug de Hb por mg de tecido úmido. O teor de Hb presente na esponja mostrou crescimento progressivo ao longo do tempo pós-implantação (4 (0,19 +/-0,05), 7 (0,99 +/- 0,19) 10 (1,54 +/- 0,13) e 14 (2,79 +/- 0,20) dias (GRÁF. 10).

Apoptose
Morfologia das células apoptóticas
    Os núcleos das células em apoptose foram marcados pelo TUNEL, ficando com uma coloração acastanhada escura, resultado da reação da Peroxidase (POD) com o seu substrato, a diaminobenzidina (DAB).
Observou-se também como critérios de inclusão as características morfológicas da apoptose como: retração e perda de adesão entre as células (anoiquia), enrugamento celular, condensação do citoplasma e do núcleo, com compactação da cromatina nuclear, fragmentação nuclear e posteriormente celular formando corpos apoptóticos.

Índice Apoptótico por tempo pós implantação

A proporção de células em apoptose em relação ao número total de células por campo microscópico foi alta no 4^o dia (31,40 +/- 1,39), decaindo no 7^o (13,90 +/- 0,87) no 10^o (19,97 +/- 1,35) e 14^o dia (17,87 +/- 0,88) sucessivamente após a implantação das esponjas (GRAF. 11).

Graf2 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 2 – Cinética das populações celulares (Macrófagos, Leucócitos, Fibroblastos e Células endoteliais) que infiltram a matriz esponjosa nos diferentes tempos após implantação.">
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GRÁFICO 2 – Cinética das populações celulares (Macrófagos, Leucócitos, Fibroblastos e Células endoteliais) que infiltram a matriz esponjosa nos diferentes tempos após implantação.

Fig1 - <div style= fiogf49gjkf0dFIGURA 1- Corte histológico de implante (7 dias), corado com AgNOR. Setas indicam os grumos enegrecidos arredondados, como pequenos satélites espalhados por todo o núcleo (NORs). Barra= 10m. À direita, detalhes da impregnação pela prata nas AgNORs nucleares de macrófagos (a), fibroblastos (b) leucócitos, (c) e células endoteliais (d).">
Fig1 -

FIGURA 1- Corte histológico de implante (7 dias), corado com AgNOR. Setas indicam os grumos enegrecidos arredondados, como pequenos satélites espalhados por todo o núcleo (NORs). Barra= 10m. À direita, detalhes da impregnação pela prata nas AgNORs nucleares de macrófagos (a), fibroblastos (b) leucócitos, (c) e células endoteliais (d).

Graf3 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 3. Distribuição das médias das AgNORs nos diferentes tipos celulares (macrófago, leucócito, fibroblasto e endotélio) nos diferentes tempos decorridos após o implante subcutâneo das esponjas">
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GRÁFICO 3. Distribuição das médias das AgNORs nos diferentes tipos celulares (macrófago, leucócito, fibroblasto e endotélio) nos diferentes tempos decorridos após o implante subcutâneo das esponjas

Fig2 - <div style= fiogf49gjkf0dFIGURA 2. Pefil da infiltração do tecido fibrovascular observado em aumento de lupa após a implana- 4 dias; b- 7 dias, c- 10 dias, d- 14 dias (picrossirius).">
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FIGURA 2. Pefil da infiltração do tecido fibrovascular observado em aumento de lupa após a implana- 4 dias; b- 7 dias, c- 10 dias, d- 14 dias (picrossirius).

Graf5 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 5. Evolução da infiltração fibrovascular e celular na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.">
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GRÁFICO 5. Evolução da infiltração fibrovascular e celular na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.

Graf6 - <div style= fiogf49gjkf0dGRAFICO 6. Evolução da atividade de MPO como fator de atividade de Neutrófilos na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.">
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GRAFICO 6. Evolução da atividade de MPO como fator de atividade de Neutrófilos na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.

Graf7 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 7. Evolução da atividade de NAG como fator de atividade de macrófagos na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.">
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GRÁFICO 7. Evolução da atividade de NAG como fator de atividade de macrófagos na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.

Graf8 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 8. Evolução da quantidade de colágenos fouxo (decrescente) e denso (crescente) como fator de atividade de fibroblastos na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.">
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GRÁFICO 8. Evolução da quantidade de colágenos fouxo (decrescente) e denso (crescente) como fator de atividade de fibroblastos na esponja por diferentes tempos de implante subcutâneo.

Graf9 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 9. Evolução da quantidade média de vasos por campo e da área media destes no campo histológico como fator de atividade de células endoteliais na esponja em diferentes tempos de implante subcutâneo.">
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GRÁFICO 9. Evolução da quantidade média de vasos por campo e da área media destes no campo histológico como fator de atividade de células endoteliais na esponja em diferentes tempos de implante subcutâneo.

Graf10 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 10. Conteúdo de Hb nos implantes de esponja para avaliar o fluxo sanguíneo nos vasos, característica de vasos maduros.">
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GRÁFICO 10. Conteúdo de Hb nos implantes de esponja para avaliar o fluxo sanguíneo nos vasos, característica de vasos maduros.

Graf11 - <div style= fiogf49gjkf0dGRÁFICO 11. Evolução do Índice Apoptótico das células presentes nos implantes de esponja nos diferentes tempos decorridos">
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GRÁFICO 11. Evolução do Índice Apoptótico das células presentes nos implantes de esponja nos diferentes tempos decorridos

    O presente estudo objetivou avaliar a cinética do recrutamento, ativação, e morte celular no tecido fibrovascular induzido pelo implante de esponjas em camundongos. A utilização de diferentes técnicas que avaliam estes parâmetros possibilitou a observação que estes são eventos distintos mas que se sobrepõem ao longo do processo no período estudado (14 dias).
    Foi observado que inicialmente a esponja implantada subcutaneamente era acelular e avascular, mas ela induz uma reação inflamatória, e diversas populações celulares foram recrutadas e migraram nos poros da matriz esponjosa formando um tecido de granulação.
    O tecido de granulação que infiltrou a esponja apresenta características de um tecido novo, consistindo de leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, fibroblastos e fibras conjuntivas, células endoteliais e vasos sanguíneos. A presença contínua do implante gerou uma resposta inflamatória característica de um processo crônico (SINGER & CLARK, 1999; MACHADO et al., 2000; FERREIRA et al., 2004).
    Aos 4 e 7 dias, o tipo celular dos implantes era composto predominantemente por leucócitos (PMN) e macrófagos. Os polimorfonucleares predominaram (GRÁF. 2), conforme esperado nesta fase, já que o processo inflamatório é agudo e o período de tempo decorrido ainda não tinha sido suficiente para o aparecimento dos fenômenos proliferativos-reparativos da inflamação, que ocorrem mais tardiamente (CLARK, 1996; KLAPLANSKI et al., 2003). Estas células estão envolvidas na primeira defesa contra organismos invasores e eliminação de corpos estranhos (GREENHALGH, 1998). A atividade de MPO que se associa com a presença de neutrófilos corrobora com a presença maciça destas células na fase inicial do processo, esta atividade foi crescente até o 10^o dia estabilizando-se no 14^o dia.
    Os macrófagos apresentam um papel crítico durante a resposta inflamatória e imune. Como outras células do sistema imune, os macrófagos são produzidos em grande escala e muitos deles são eliminados pelo mecanismo de apoptose (XAUS et al., 2001). Os macrófagos são os orquestradores chave do reparo dos tecidos, liberando uma série de fatores de crescimento e citocinas (KORN et al., 1980; DIELGEMANN et al., 1981). A atividade de NAG (considerada como estimativa bioquímica da população de macrófagos) foi crescente, com valores mais elevados aos 14 dias após o implante. A quantidade de macrófagos aumentou gradativamente do 4^o até o 10^o dia, estabilizando-se no 14^o dia, o que indicou uma correlação positiva entre a quantidade destas células e seu produto – o NAG.
    Na fase proliferativa (7-10 dias), a quantidade de polimorfonucleares permaneceu constante enquanto os outros tipos celulares apresentaram um aumento gradativo em suas populações, e a presença de fibroblastos e das células endoteliais foi marcante. As citocinas e os fatores de crescimento liberados pelas células inflamatórias ativam e atraem os fibroblastos (HUNT et al., 1984). Os fibroblastos migram, proliferam e depositam colágeno, participando da formação do tecido de granulação sendo a resposta fibroblástica importante na reparação das lesões (GRINNELL, 1994; DEMOULIERE et al., 1997). Como resultante da ativação dos fibroblastos detectou-se, nestes experimentos, maior quantidade de colágeno denso, que forma fibras e menor quantidade do outro mais frouxo. A técnica utilizada, descrita por JUNQUEIRA et al. (1979), utilizou o Picrosirius Red - um composto aniônico que distingue a espessura e densidade das fibras colágenas pela coloração emitida sob luz polarizada, caracterizando como colágeno tipo I o mais denso e o colágeno tipo III como o mais frouxo.
    O colágeno tipo III geralmente é o primeiro colágeno a aparecer, é abundante nos vasos e constitui um estroma de fibras mais delicadas (JEFFREY et al., 1996). No tecido fibrovascular da esponja, não foi possível a visualização do colágeno frouxo nos primeiros dias pós implantação, talvez pela dinâmica e rápida evolução do processo, que substitui prontamente o colágeno tipo III pelo do tipo I, formando um estroma mais denso. Do 10^o para o 14^o dia observou-se uma diminuição significativa de colágeno frouxo. Já o colágeno denso apresentou um aumento gradativo em sua quantidade de acordo com o aumento do tempo de implante, mas no 4^o dia este tipo de colágeno também não foi detectado. O colágeno tipo I induz as células endoteliais a assumirem uma morfologia fusiforme e a se alinhar em sólidos cordões. Estes cordões assemelham-se aos sólidos cordões pré-capilares da angiogênese embrionária, importantes para o processo de angiogênese (DELVOS et al., 1982; MONTESANO et al., 1983; JACKSON et al., 1994; RICHARD et al., 1998; SWEENEY, 1998).
    A angiogênese é um fator importante nos processos de reparação pois os novos vasos fornecem nutrientes e oxigênio para o tecido de granulação (AUERBACH & AUERBACH, 1997; FREDERICK et al., 1984; NISSEN et al., 1998; RIBATTI et al., 2001). Neste estudo, as células endoteliais não foram detectadas no 4^o dia após o implante da esponja, mas apresentaram um aumento progressivo a partir do 7^o. Como evolução natural da proliferação, migração e diferenciação das células endoteliais, observou-se que os vasos são mais numerosos no 10^o dia, diminuindo na avaliação morfométrica no 14^o dia. Observou-se um aumento progressivo no número de células endoteliais, no calibre do vasos e no conteúdo de Hb aos 14 dias pós implantação, sugerindo fusão de alças vasculares e indicando maior maturação e funcionalidade dos vasos, com o decorrer do tempo de implantação. Além disso, vasos menores e não necessários poderiam ficar colabados e mesmo estarem sendo reabsorvidos.
    Embora os resultados obtidos com a análise morfométrica possibilitaram uma descrição do perfil da celularidade na matriz esponjosa, foi apenas a marcação com o AgNOR que permitiu avaliar diretamente o estado de ativação das populações celulares nos diferentes intervalos estudados.
    A técnica de AgNOR tem sido amplamente utilizada com marcador da atividade de proliferação tumoral (TRERÈ et al., 1989, DERENZINI et al., 1990). Neste trabalho, foi utilizada para quantificar a atividade em tecido não neoplásico, em modelo de angiogênese inflamatória. Estudos utilizando esta técnica em patologia ortopédica indicaram números médios de AgNOR por célula variando entre 2.9 +/- 0.1 em traumas articulares, 3.6 +/- 0.05 na Osteoartrite e 4.3 +/- 0.3 na artrite reumatóide e 7.3 +/- 0.3 no sarcoma sinovial. (SCHASER et al., 1996).
    Ao lado de sua função no controle do ciclo celular, as AgNORs são também bases para a produção de subunidades ribossomicas. Em células engajadas na síntese de proteínas, mais AgNORs serão ativamente transcritas para manter o número de ribossomos necessários para este processo e portanto mais AgNORs serão citologicamente demostradas (UNDERWOOD & GIRI, 1988; DERENZINI & TRERE, 1991). O valor da quantificação de AgNORs como um índice de síntese protéica tem sido confirmado em poucos estudos sobre tecidos saudáveis com limitado ou nenhum potencial mitótico (JOZSA et al., 1993; POLLOK, 1997).
Inicialmente a ativação celular quantificada pela expressão de AgNORs apresentou-se elevada nos tempos de 4 e 7 dias aumentando no 10^o dia e diminuindo drasticamente no 14^o dia. A ausência ou escassez de celularidade inicial da matriz esponjosa pode ter sido um fator na alta taxa de ativação celular observada inicialmente. Já no 14^o dia o número de AgNORs observado em todos os tipos celulares sofre uma diminuição, é possível que nesta fase a matriz esponjosa já estivesse suficientemente ocupada por células, e ocorrendo o início da resposta de resolução da inflamação causada pela esponja. A alta expressão das AgNORs inicialmente nas células como leucócitos e macrófagos pode estar associada à alta atividade inflamatória destas células na matriz esponjosa, já aos 14 dias a resposta inflamatória dá sinais de resolução e a atividade celular diminuiu. A maior expressão das AgNORs precedeu o aumento da celularidade para fibroblastos e células endoteliais no modelo de angiogênese inflamatória, sustentando sua aplicação como índice de proliferação das células lábeis nos tecidos, tal como demonstrado em tecidos tumorais (CROCKER et al., 1988, HÖRLIN et al., 1992). Muitos procedimentos podem medir a atividade de proliferação celular nas lesões tumorais e os mais utilizados são os marcadores MIB1/Ki67, PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular) e bromodeoxiuridina (BrdU), além das AgNORs (TRERÈ et al., 1989, DERENZINI et al., 1990). A cinética de proliferação celular obtida pela técnica de AgNOR se compara aos resultados obtidos com BrdU e MIB1 por outros pesquisadores (OEHMICHEN & CRÖPELIN, 1995;CROCKER et al., 1990; ORITA, 1990). No processo de cicatrização, a análise morfométrica das AgNORs é importante na definição da fase evolutiva da lesão e permite quantificar a ativação e a proliferação celular. Além disso, trata-se de um método rápido, econômico e possível de ser implementado facilmente na rotina de amostras teciduais (GODOY et al., 2000).
    Quando analisou-se os vários tipos celulares separadamente, pôde-se observar uma variação temporal na expressão das AgNORs. Após a diapedese e migração para o foco das lesões de pele, os PMNs demonstram uma resposta transcricional significante que inclui genes de várias categorias funcionais diferentes, de maneira a regular a sua função e destino no reparo de feridas (THEILGAARD-MONCH, 2004). Neste estudo os leucócitos e macrófagos são ativados, migram para a matriz esponjosa, e produzem MPO e NAG, sucessivamente.
    Nos núcleos dos leucócitos e macrófagos, a alta expressão de AgNORs aos 7 e 10 dias precedeu à ativação subsequente, no 10o e 14o dias, indicando uma relação positiva entre a quantidade de AgNORs / número de células. Os fibroblastos, que apresentaram-se inicialmente em quantidades muito baixas (GRAF. 1), ainda que o número de AgNORs expressos por núcleo/fibroblastos tenha sido alto (GRAF. 2). Assim, o aumento subsequente progressivo e intenso do número de fibroblastos e de colágeno foi precedido pela maior expressão das AgNORs. As células endoteliais apresentaram um aumento na expressão de AgNORs nos núcleos até o 10^o dia o que também precedeu o aumento subsequente da população destas células e do número de vasos no próximo tempo estudado (14o dia).
    A baixa expressão de AgNORs no 14^o dia pós-implantação observada em todos os tipos celulares estudados parece estar associada à consecutiva diminuição ativação e proliferação indicando o início da fase de resolução do processo. Foi observado que após 21 dias de implantação o tecido de granulação apresentou-se fibrosado e com um baixo número de células (dados não publicados).
    A menor quantidade de tecido fibrovascular na esponja no 7^o dia, com pequeno número de células e menor quantidade de colágeno tipo I, contrastou com o alto número de vasos em relação aos dias subsequentes. O grande número de vasos estava associado com pequena área média destes vasos, indicando se tratar de novos brotamentos vasculares. A angiogênese é um processo precoce, já sendo detectável na reação inflamatória causada pela matriz sintética nos primeiros sete dias (ANDRADE et al., 1987, KYRIADES et al., 2001) e também precocemente em vários modelos experimentais (HU et al., 1995; FERREIRA et al., 2004). Já no 10^o dia após o implante das esponjas, a quantidade de tecido fibrovascular aumentou devido ao incremento da quantidade de células, de colágeno e do número e diâmetro dos vasos. Nesta ocasião, o tecido de granulação já está mais exuberante, ativo e maduro (KYRIADES et al., 2001; MACHADO et al., 2000). Posteriomente, no 14^o dia, o tecido de granulação presente na esponja aumentou possivelmente devido ao aumento da deposição do colágeno tipo I.
    A lesão tecidual associada à inflamação é seguida pelo reparo onde o agente irritante aos tecidos desaparece ou é inativado pela resposta do hospedeiro. No processo fisiológico de resolução da inflamação e no reparo de feridas, o mecanismo central de diminuição da celularidade no tecido de granulação é por apoptose. Esta é a via universal de eliminação de células desnecessárias e ocorre sem suscitar incremento de fatores inflamatórios. (DESMOULIERE et al., 1995, BROWN et al., 1997; GREENHALGH, 1998). A estabilização ou diminuição do número de leucócitos (predominantemente PMNs) após o 7o dia do implante e de macrófagos após o 10^o (GRAF. 2) sugerem modulação da resposta inflamatória e evolução para resolução. O alto índice de apoptose no 4^o dia do implante pode estar associado com a mudança do perfil da inflamação, que deixa de ser aguda e começa a se cronificar, com a diminuição de PMNs, que têm uma vida média muito curta e predominam na fase aguda da inflamação, e mostra. A remoção dos PMNs por apoptose é um importante fator no controle da inflamação (HASLETT & HENSON, 1996; GREENHALGH 1998, WARD et al., 1999; MURPHY et al., 2003).
    A massa do tecido de granulação deve ser controlada e limitada para prevenir uma remodelação anárquica e o desenvolvimento de fibrose. O mecanismo responsável por isto é a apoptose (DEMOULIERE et al., 1997). A apoptose de células inflamatórias pode influênciar a resposta imune através do aumento ou supressão da inflamação. Por isto, células mortas, que são um reflexo do passado imediato do organismo, podem controlar seu futuro imunológico (SAVILL et al., 2002).
    Em suma, a homeostase no tecido de granulação é mantida através do equilíbrio entre a proliferação, diferenciação e a morte celular (DEMOULIERE et al., 1995).
Neste experimento, logo após a implantação da esponja, foi observado o maior índice apoptótico já no 4o dia. É possível que isto tenha ocorrido como um mecanismo de contenção do processo inflamatório, como descrito por SIMPSON & ROSS (1972). Para estes autores, a resposta neutrofílica deve ser controlada por mecanismos como a apoptose para que a lise tecidual não seja amplificada sendo um pré–requisito para a homeostasia da inflamação (POPE, 2002). No 7º dia após o implante da esponja o índice apoptótico foi o mais baixo, provavelmente por se associar com o pico de celularização do implante, que ocorreu subsequentemente. O índice apoptótico também se elevou no final do período estudado (no 10º e 14ºdia), após a fase de maior proliferação, acompanhando a resolução do processo, possivelmente ajudando a conter a fibroplasia e a angiogênese. Assim, a ocorrência da apoptose parece estar associada com o controle da celularidade e do recrutamento dos diversos tipos celulares. A apoptose tem um importante papel, não só controlando, mas regulando as fases iniciais do processo de angiogênese inflamatória.
    Neste trabalho, utilizando-se parâmetros morfométricos e bioquímicos, foi possível demonstrar a cinética da infiltração, ativação e apoptose das células que compõem o tecido fibrovascular induzido por implante de esponjas em camundongos. Os resultados obtidos neste modelo de angiogênese inflamatória confirmam os dados da literatura quanto a sequência regular da infiltração de diferentes populações celulares no processo de cicatrização de feridas observados em outros modelos. Além disso, estes resultados espandem as possibilidades de futuras investigações sobre processos patológicos que envolvem deficiências no reparo tecidual.

A implantação cirúrgica da matriz esponjosa em camundongos induz a formação de um tecido fibrovascular, no qual é possível determinar componentes inflamatórios e angiogênicos.
Estes componentes inflamatórios e angiogênicos podem ser avaliados por técnicas morfométricas e bioquímicas, que demostram a cinética da infiltração, ativação e apoptose nas diversas células envolvidas:
A análise morfométrica da vasculatura é corroborada pela dosagem da Hb na determinação do índice vascular;
A presença e ativação dos diversos tipos celulares são demostrados por marcadores específicos e morfometria. Enzimas citosólicas mensuradas como suporte auxiliar sustentam a quantificação de células inflamatórias. O colágeno quantificado evidencia a ativação e diferenciação de fibroblastos. Ocorre a maturação do colágeno com o decorrer do processo.
A técnica de AgNOR avalia a atividade proliferativa deste novo tecido. A maior expressão das AgNORs precede a ativação e o aumento da celularidade no modelo de angiogênese inflamatória sugerindo sua aplicação como índice de proliferação para os fibroblastos e células endoteliais e como índice de ativação para os leucócitos e macrófagos.
A apoptose avaliada pela técnica de TUNEL demostra claramente que o padrão do índice apoptótico tem fases distintas, sendo já intensa no início e também no final do processo. Assim, mesmo precocemente a apoptose atua na modulação renovando células de curta sobrevida.

Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão da bolsa de estudos, essencial para o desenvolvimento deste trabalho.
-A FAPEMIG - Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, pelo apoio financeiro (CBB 312/03 – 7149 – FAPEMIG/ICB/DPG/APOPTOSE - UNIVERSAL).

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- Lucía González Núñez (24/05/2007 14:58:38)

Dra. Lucía González Núñez
Felicito a los autores por el excelente trabajo realizado, asi como por la calidad de las técnicas y las excelentes ilustraciones
Este trabajo constituye por su calidad, un estudio de referencia
Muito obrigada

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