Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica


Direccion de contacto
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• Dr. Juan Carlos Roa.
Departamento de A. Patológica.
Facultad de Medicina.
Universidad de la Frontera.
Manuel Montt 112
Código Postal 478-1176
Temuco, Chile
Jcroa@ufro.cl

Patrón de Metilación génica en el cáncer de la vesícula biliar

Juan Carlos Roa S*, Angélica Melo A*, Leonardo Anabalón*, Oscar Tapia E*, Xabier de Aretxabala U**, Iván Roa E***
* Departamento de Anatomía Patológica, Universidad de La Frontera, Temuco CHILE
** Departamento de Cirugía, Clínica Alemana de Santiago CHILE
*** Departamento de Anatomía Patológica, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
Departamento de Cirugía, Clínica Alemana de Temuco. CHILE

Resumen

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La metilación de la región promotora de genes es un importante mecanismo en la inactivación de genes supresores de tumores.
Objetivo Analizar el patrón metilación de importantes genes involucrados en procesos  carcinogenéticos  de la vesícula biliar, correlacionándolas con su expresión inmunohistoquímica, características anatomoclínicas y sobrevida de los pacientes.
Material y Método Se seleccionaron 20 casos de cáncer de vesícula biliar del banco de tumores congelados. El ADN extraído fue analizado mediante el test de metilación específica por PCR para los Genes CDKN2A (p16),  hMLH1, APC, FHIT y CDH1 (Caderina –E). Se obtuvo datos anatomoclínicos y seguimiento de  la totalidad de los pacientes.
 Resultados: La totalidad de los casos correspondió a tumores avanzados (95%) histológicamente moderada o pobremente diferenciados (95%).Se observó metilación del área promotora de los genes en 5%, 20%, 30%, 40%, 65% y un  patrón inmunohistoquímico alterado (PIA) en 5%, 35%, 21% ,25%, 66%  para los genes hMLH1, CDKN2A,  FHIT, APC y Caderina-E respectivamente. El indice de concordancia Kappa fue casi perfecto entre metilación del área promotora y  PIA para los genes hMLH1 y Caderina E  y substancial para APC. No se encontró correlación entre sobreviva y la metilación de los genes estudiados.
Conclusiones: La alta frecuencia de de metilación  génica (con la excepción de hMLH1) y la alta correlación de PIA y metilación del área promotora génica  para los genes hMLH1, APC y Caderina E, sugieren que la metilación es un mecanismo importante  en su inactivacion,  jugando probablemente  un rol en la tumorogénesis vesicular.

 

Introduccion    

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Existen escasos estudios comunicados respecto de la carcinogénesis vesicular se han enfocado a detectar la mutación de genes dominantes como K-ras (1-4)o la inactivación de genes supresores de tumores mediante Mutación o deleción alélica(2, 5-8). Recientemente estudios  de extensa alelotipificación  cromosómica han mostrado que existen deleciones alélicas  múltiples en diferentes  sitios del genoma humano,  sugiriendo la participación  de numerosos genes supresores de tumores en esta neoplasia(9).
 La metilación del ADN es el cambio epigenético más frecuente e importante en tumores humanos, incidiendo directamente en  la inactivación de los genes supresores de tumores como mecanismo alterno a la mutación y deleción alélica, La inactivación por metilación afecta directamente procesos tan importantes como el ciclo celular, la reparación del ADN y aquellos involucrados en la invasión y metástasis. (10, 11)
En las células tumorales existe un estado de hipometilación del ADN genómico p, sin embargo, se observa hipermetilación en regiones ricas en citocinas y guaninas (islotes CpG), en las zonas que están ubicadas frecuentemente cerca o dentro de las áreas promotoras génicas, en aproximadamente la mitad de los genes humanos conocidos. (12-14). La hipermetilación de estas áreas produce represión transcripcional debido a un cambio en la estructura de la cromatina, que la hace inaccesible a los factores de transcripción, y de esta manera inactiva a los genes involucrados en las distintas vías carcinogenéticas. Este fenómeno ha sido reportado en varios tipos de tumores, lo que ha permitido establecer patrones específicos de metilación en  diferentes subgrupos de tumores. (15, 16). El adecuado entendimiento  de los perfiles de metilación tumoral  puede tener un impacto  en importantes problemas clínicos como  la detección precoz, quimioprevención, pronóstico y tratamiento de las enfermedades neoplásicas (10)
Nuestro objetivo fue examinar el patrón de metilación de la región promotora de genes involucrados en distintas vías carcinogenéticas en carcinomas vesiculares avanzados, además relacionar su expresión   inmunohistoquímica  y algunas características clínicas y  morfológicas asociadas a pronósticos diferentes.

 

Material y Método    

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Casos: se seleccionaron 20 casos de pacientes con cancer avanzado de vesícula biliar del banco de tumores del Departamento de Anatomía Patológica de la Universidad de la Frontera. Todas las muestras fueron mantenidas  en gel criopreservante (Jung, Alemania) a -70ºC. Se seleccionó un área tumoral  mediante corte de congelación  y se fragmentó en cámara  fría.  En todos los pacientes se obtuvo seguimiento completo y las características  clínicas  de la serie se obtuvieron desde  los registros médicos. Para la clasificación morfológica  de los tumores se utilizaron los criterios de la OMS(17) y la clasificación TNM(18).

 Se seleccionó los genes supresores de tumores relacionados con el ciclo celular FHIT (Fragile Histidine Triad), CDKN2A (p16) y APC (Adenomatous Poliposis Coli). El gen hMLH1 (Human Mut Homologue 1)  (19)probablemente el más importante de los genes reparadores de ADN genómico, relacionado con inestabilidad microsatelital (20)y el gen CDH1 (Caderina E), que codifica una proteína de transmembrana que participa en el complejo de moléculas de adhesión  involucrada en la metástasis e invasión tumoral. (21)

 El criterio de selección de los genes estudiados, se basó básicamente en la incidencia de estos en las distintas vías carcinogenéticas de tumores digestivos  en humanos. (22, 23)

Extracción del ADN: Se realizó según protocolo  del Kit de Aislamiento de ADN Genómico Puregene (GENTRA, USA). Brevemente, los fragmentos de tejido  se incubaron a 65ºC  en   tubos Eppendorf  de 1,5ml  con solución de lisis celular y  proteinasa K (10mg/ml)  hasta observar lisis tisular total. Las proteínas fueron eliminadas por precipitación en acetato de amonio 7,5M pH 7,5. El ADN fue precipitado con isopropanol, lavado con etanol 70%, resuspendido en solución de hidratación (buffer TE pH 8.0) y almacenado a -20ºC.

Prueba de metilación especifica mediante PCR (MSP)

Modificación con Bisulfito: El principio de la modificación  de ADN con la técnica de bisulfito de sodio se basa en su capacidad de convertir a todos los residuos de citosina (C) no metiladas en uracilos (U)  mediante deaminación, la citosina metilada es resistente a la reacción  y permanece como citosina(24). Los iniciadores de PCR utilizados aprovechan estas diferencias para discriminar entre aquellas secuencias metiladas y no metiladas.  Se usó protocolo previamente descrito. (23, 24).

Amplificación  del ADN: Las secuencias de  partidores y condiciones de PCR han sido previamente descritas. (23) Las reacciones fueron realizadas con aproximadamente 100 ng de ADN genómico modificado, 0,2 µM de cada iniciador, 200 µM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfatos, 1,5 mM de MgCl y 0,75 U de Taq Polimerasa (Promega) en un volumen final de 25 µl. Se usó como control negativo 100 ng de ADN genómico sin modificar. Como control positivo de metilación se utilizó   ADN genómico comercial (Promega) metilado con SssI (Biolab) y como control negativo,  ADN  genómico (Promega) no  metilado  modificado.

Los productos de PCR, fueron visualizados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% en buffer TBE  y de agarosa al 2% en buffer TAE, teñidos con bromuro de etidio (Figura 1).

 Se utilizó el índice de metilación como un indicador de la proporción de regiones promotoras metiladas respecto de la totalidad de los genes estudiados y se calcula dividiendo el número de genes metilados por el número de genes analizados.

Estudio Inmunohistoquímico:   Se utilizó la técnica  estándar  Streptavidina-Biotina (Biogenex) para tejidos frescos congelados. No se realizó recuperación antigénica La incubación de los anticuerpos primarios APC (Clon C-20), p16 (clon F-12), E-Cadherin (clon C-19) de  Sta. Cruz California.  Y FHIT policlonal, MLH1 (Clon 14) de Zymed laboratories, Inc South San Francisco, California) en concentración 1:50. Posteriormente  fueron incubados con  anticuerpo secundario 1:320 (multilink biotinylated) (Biogenex),  durante una hora y finalmente revelados con diaminobenzidina. En cada prueba se emplearon controles negativos y positivos. En los controles negativos se  sustituyó el  anticuerpo primario por suero normal, y como control positivo se  utilizaron casos de carcinomas del colon, en los que previamente se había demostrado positividad para estos antígenos.

Patrón inmunohistoquímico alterado (PIA). Se consideró la presencia de un PIA  cuando se obtuvo ausencia de tinción inmunohistoquímica en el tumor y positividad en el infiltrado inflamatorio o en la mucosa tumoral adyacente.  Estos genes supresores normalmente producen una proteína que ejercen el efecto supresor tumoral  sin embargo  al producirse la inactivacion del gen, sea esta por metilación, mutación, deleción o combinación de ellos,  no produce la proteína y por lo tanto no es detectada mediante la IHQ (Figura 2).

Análisis Estadístico. La relación entre el estado de metilación génica  con variables categóricas tales como sexo, raza, tipo histológico usando la prueba  de X2 o la prueba exacta de Fisher. Para variables numéricas como edad se utilizó la prueba de t-student.. Para el calculo de sobrevida  y su asociación con parámetros morfológicos  y clínicos y metilación génica se construyeron curvas de Kaplan Meier y fueron comparadas utilizando la prueba de log-rank y el modelo de Cox Hazard. Para la medición de la concordancia entre metilación y PIA  se utilizó la prueba estadísticoa de Kappa. En este, el valor Kappa de 1.0  fue considerado perfecto los valores entre 1.0 y 0.75 fueron considerados casi perfectos, entre 0.45 y 0.75 substanciales, entre 0.20 y 0.45 moderados  y menor a 0.20 malo. (ref Muñoz)

 

Figura 1 - <div style=fiogf49gjkf0dFigura 1. Fotografía compuesta de geles de agarosa que muestra el resultado del análisis de metilación en los 5 genes estudiados donde se puede observar el tamaño variable de las bandas amplificadas. M= control positivo ADN genómico metilado y modificado, NM= control negativo ADN genómico no metilado y modificado y B= Blanco. ">
Figura 1 -

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Figura 1. Fotografía compuesta de geles de agarosa que muestra el resultado del análisis de metilación en los 5 genes estudiados donde se puede observar el tamaño variable de las bandas amplificadas. M= control positivo ADN genómico metilado y modificado, NM= control negativo ADN genómico no metilado y modificado y B= Blanco.


Figura 2 - <div style=fiogf49gjkf0dFigura 2. Ejemplos de patrones de inmunohistoquímicos observados para los genes estudiados. Nótese la negatividad de las células tumorales para los genes hMLH1 (D) y CDKN2A(p16)(E) en relación con las células inflamatorias adyacentes (control interno positivo) y las áreas tumorales reactivas y no reactivas para CDH1 (B). ">
Figura 2 -

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Figura 2. Ejemplos de patrones de inmunohistoquímicos observados para los genes estudiados. Nótese la negatividad de las células tumorales para los genes hMLH1 (D) y CDKN2A(p16)(E) en relación con las células inflamatorias adyacentes (control interno positivo) y las áreas tumorales reactivas y no reactivas para CDH1 (B).




Resultados    

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Características clínicas
Las características generales del grupo estudiado se observan en la Tabla 1. Este fue mayoritariamente de sexo femenino (80%) y no mapuche (85%). La serie presentó una edad promedio de 62.5 años. La sobrevida en promedio fue de 10,7 meses con un rango de 1 a 66 meses.
La mayoría de los casos se  correspondió a tumores subserosos o serosos (95%). En relación al grado de diferenciación, la  mayoría correspondió a tumores poco y moderadamente diferenciados (55% y 40% respectivamente). La totalidad de los casos correspondieron a  adenocarcinomas tubulares.
Estado de metilación génica.
Las frecuencias de metilación de la región promotora de los genes estudiados en los 20 casos de tumores de vesícula biliar analizados (Tabla 2), fluctuaron entre 5% para hMLH1 y 65% para CDH1.  Los genes p16, FHIT y APC  presentaron frecuencias de metilación similares (20% , 30% y 40% respectivamente). Observamos  una interesante tendencia entre la metilación de CDH1 y la presencia de tumores poco diferenciados (p=0.06). 
Estudio Inmunohistoquímico: Encontramos un pia   en 5%, 35%, 21% ,25%, 66%  para los genes hMLH1, CDKN2A,  FHIT, APC y Caderina-E respectivamente. La concordancia entre metilación del área promotora y  PIA  presento valores elevados de Kappa (K) para los genes hMLH1 (K=1.0; p<0.0001), APC (K=0.66, p<0.001) y Caderina-E (K=0.75; p<0.001). Par el gen CDKN2A  el porcentaje de acuerdo fue de 59% con nivel 0.39 de Kappa, sin embargo  se observo un p<0.05. No se observó correlación  entre el PIA y  sobrevida ni características morfológicas de los tumores.
         No se encontró relación entre la sobrevida de los pacientes con el patrón de metilación de los genes analizados.
         El índice de metilación se resume en la Tabla 3. El 75% de los casos presentaron 1 o más  genes metilados es decir un índice de metilación de 0.2 o superior.
 
Tabla 1. Características generales y morfológicas del grupo estudiado(n=20)
SEXO
FEMENINO
MASCULINO
80% (16)
20% (4)
EDAD
PROMEDIO
RANGO
 
62,5 años
41 a 86 años
ETNIA
NO MAPUCHE
MAPUCHE
 
85% (17)
15% (3)
SOBREVIDA
PROMEDIO
RANGO
 
10,7 Meses
0-66 Meses
FALLECIDO
SI
NO
 
65%(13)
35%(7)
GRADO  DE DIFERENCIACION
 
 
BIEN
MODERADO
POCO
5% (1)
40% (8)
55% (11)
NIVEL INFILTRACION
SUBSEROSA
10% (2)
 
SEROSA
90% (18)
 
Tabla 2. Metilación del promotor y Patrón IHQ alterado.
GEN ANALIZADO
METILACION
INMUNOHISTOQUIMICA
KAPPA
hMLH1
5% (1)
5% (1/20)
1.0
P<0.0001
CDNK2A (p16)
20% (4)
35% (7/20)
0.39
P<0.05
FHIT
30% (6)
21%(4/19)
0.19
P=0.186
APC 1A
40% (8)
25% (5/20)
0.67
P<0.001
CDH1 (CADERINA E)
65% (13)
66% (12/18)
0.75
P<0.001
Genes que mostraron alta concordancia  en la metilación génica y la IHQ
 
Tabla 3. Indice de metilación.
INDICE DE METILACION
5 GENES
0
25% (5)
0,2
20% (4)
0,4
25% (5)
0,6
25% (5)
0,8
5% (1)
1
0% (0)

 

Agradecimientos    

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Trabajo financiado por  Fondecyt   1050603 y Diufro 120333.

 

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Comentarios

- Cesáreo Corbacho Cuevas (25/10/2005 20:04:10)

Un trabajo muy interesante que se complementa con el de la comunicacion anterior, tambien del mismo grupo. Llama la atencion el hecho de que en el cancer de vesicula biliar no parecen jugar un papel protagonista, en la mayoria de los casos, las mutaciones de K-Ras y si, en cambio, las metilaciones de hMLH1, APC y Caderina E. Enhorabuena, muchas gracias y un saludo muy cordial.

- Cesáreo Corbacho Cuevas (26/10/2005 10:10:30)

Creo que ha habido un lapsus sin importancia en la sección "Resultados", apartado "Estudio de la metilación génica", en donde se dice que se han estudiado 20 casos de tumores de estómago, en lugar de vesícula biliar. Me gustaría, además, ratificar lo que dije ayer: que me parece un trabajo muy interesante y que se complementa con la comunicación anterior, al aportar que la metilación de los genes estudiados, o de sus promotores, puede jugar un papel importante en el desarrollo del cáncer de vesícula biliar, y que puede ser menos importante, en esta localización, el papel que jueguen las mutaciones de Ras. Se pone de manifiesto, además, la importancia de contar con un buen Banco de Tumores congelados, no sólo para investigación sino también, en un futuro no muy lejano, para fines asistenciales. Enhorabuena, muchas gracias y un saludo muy cordial.

- Juliana Fariña (30/10/2005 2:36:03)

Enhorabuena, un trabajo muy interesante. La anatomia patologica cambia por este camino, sacando numerosos datos que tenemos que unir a la clinica para que el metodo anatomoclinico, como siempre, haga avanzar la medicina. Juliana fariña

 

 

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