Comunciación libre
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E. Moro-Rodríguez*, J. Figols**, M. Alvira***, H. Fernández-García*, G. Burmer***, C. Roush***, S. García-Gómez de las Heras*, MP. Nieto-Bona*, JA. Uranga-Ocio*, E. García-Poblete* |
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RESUMEN: Introducción:
Los receptores alpha 1-adrenérgicos (ADRA1) son proteínas
G transmembrana que se activan mediante compuestos adrenalina-like.
Hay tres subtipos de ADRA1 en humanos: alpha (1A)-AR; alpha (1B)-AR;
y alpha (1D)-AR. Actualmente es poco lo que se conoce acerca de la
localización específica de cada uno de estos subtipos
en los tejidos humanos. En el presente trabajo analizamos la
inmunorreactividad en tumores derivados de la estirpe glial de un
anticuerpo policlonal (379-LP1248) producido contra una única
secuencia peptídica del ADRA1A.
Material y Metodos: Se han estudiado muestas de tejido incluido en parafina de veinticuatro pacientes diagnosticados de oligodendroglioma (OD) y 3 de Glioblastoma multiforme (GBM). Hemos realizado técnicas de imnunohistoquímica, inmunofluorescencia y microscopía confocal para colocalizar de forma cuantitativa la expresión de 379-LP1248 y la proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Se ha utilizado también yoduro de propidio para contrateñir el ADN de los núcleos. Resultados: Doce de 24 ODs mostraron una tinción moderada y en nueve casos la reacción fue intensa. Los coeficientes de correlación entre los receptores de ADRA1A o la GFAP y la muerte de los pacientes fueron significativos (p=0.01). Los tres GBM mostraron tinciones sólo en oligodendrocitos atrapados entre los astrocitos malignos. La construcción de las gráficas de supervivencia de Kaplan-Meier sugirió que los OD grado III, con un tiempo de supervivencia media de 36 meses y mediana de 24 meses, tenían un peor pronóstico que los OD grado II con un tiempo medio de supervivencia de 72 meses. El tiempo de supervivencia de los OD con baja intensidad de fluorescencia para ADRA1A (150-498) fue de 66.43 meses (mediana 96 meses) mejor si lo comparamos con el tiempo medio de supervivencia de 54 meses (mediana 24 meses) que presentaron los OD con una alta intensidad de fluorescencia para ADRA1A (502-1107). Conclusión: En los Oligodendrogliomas humanos la mayor expresión de los receptores ADRA1A parece ser un indicador independiente de peor pronóstico y menor supervivencia.
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Las células de la glia consituyen uno de los componentes principales del sistema nervioso central, después de las neuronas. Los oligodendrocitos no solo se han relacionado en nuestro día con la formación de la mielina de las fibras nerviosas (oligodendrocitos interfasciculares) sino que también intervendrían con las neuronas en el intercambio bioquímico de sustancias (oligodendrocitos satélite). Clásicamente se había relacionado a los oligondedrocitos con el desempeño funciones estructurales de sostén de la red neuronal. Sin embrago, nuestra atención se está centrando cada vez más en nuevas funciones tanto moduladoras como de neurotransmión (Stone 1989). Los oligodendrogliomas (OD) son tumores
que manifiestan en algunas circunstancias un comportamiento clínico
impredictible. Se suelen presentar principalmente en pacientes entre
los 30 y los 40 años, generalmente debuntando con síntomas
focales de larga evolución aunque en algunas ocasiones el
crecimiento tumoral es muy rápido. Desde las primeras
descripciones realizadas por Bailey y Bucy se ha reconocido una
mezcla de poblaciones entre las células neoplásicas, al tiempo que desde entonces
resulta dificil predecir el comportamiento biológico si nos
limitamos exclusivamente con la descripción de sus hallazgos histopatológicos
(Barley 1929). En nuestros días, los investigadores han centrado sus estudios en describir y caracterizar la significación que tendrían las delecciones citogenéticas que estos tumores presentan con relativa frecuencia tanto en el brazo corto del cromosoma 1 como en el brazo largo del cromosoma 19 (Smith 1999). Del mismo modo proliferan los trabajo que describen diferentes marcadores para éstas células aunque, desafortunadametne, no hay por el momento ningún anticuerpo que se considere específico de los ODs (Wharton 1998). El receptor alpha 1-adrenergico (ADRA1) es una proteína G trans-membrana que se activa mediante compuestos adrenalina-like. Se han descrito tres subtipos de adrenoceptores en humanos: el alpha (1A)-AR cuyo gen se localiza en el cromosoma 8; el alpha (1B)-AR en cromosoma 5; y el alpha (1D)-AR en el cromosoma 20. Se conoce muy poco acerca de la localización específica de cada uno de éstos subtipos en los tejidos humanos. El alpha 1-AR se ha relacionado con varios procesos fisiológicos esenciales tales como la neurotransmisión, la regulación del tono vascular, de la contración del músculo liso y cardiaco o el metabolismo hepático. Éstos receptores se han encontrado en el músculo liso de las arteriolas y venas, en el ojo, aparato digestivo, y piel así como en otros tejidos como las glándulas salivares y células nerviosas en el cerebro. En los tejidos vasculares se piensa que la contracción de las células musculares lisas depende de la vía proteinaG(q/11) que ocasionaría un incremento de la concentarción de calcio. Auque se han clonado diferentes subtipos de receptores procedentes de genes separados, la comparación de sus secuencias ha demostrado que existe un alto grado de homología y es poco lo que se conoce acerca de la localización específica de cada uno de los distintos subtipos en los tejidos humanos (Domyancic 1997), (Assari 2003). En el presente trabajo analizamos y describimos la inmunolocalización de un anticuerpo policlonal de conejo (379-LP1248) producido por Life Span Biosciences, Seattle (WA) contra una única secuencia peptídica de Alpha 1-a adrenoceptor (ADRA1a) de cerebro normal humano, en veintiseis oligodendrogliomas y tres glioblastomas multiformes (GBM) de muestras de tejido de archivo que se encontraban embebidos en parafina.
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Hemos estudiado veinticuatro
oligodendrogliomas y dos recurrencias que se obtuvieron del archivo
del Departamento de Patología del Hospital Marqués de
Valdecilla, Santander (España). Todos los casos tenían
entre 5 y más de 10 años de seguimiento habiendo sido
diagnósticado el más antigüo en 1981. Se
utilizaron para el estudio muestras tumorales de archivo que habían
sido incluidas en parafina. Cada uno de los casos fueron
caracterizados según su edad, sexo, fecha de diganóstico,
grado histológico de acuerdo con la clasificación de la
OMS y evolución clínica.
El anticuerpo 379-LP1248 fue generado por Life Span Biosciences, Seattle (WA) mediante un péptido de 16 aminoácidos que se localizaba en el tercer loop citoplásmico del receptor alpha 1A Adrenoceptor. La comparación de la secuencia de éste péptido con otros miembros de la misma familia de proteínas mostró una variación muy pequeña en cuanto a su homología. El péptido fue purificado mediante HPLC al 95% de pureza, se conjugó con KLH, y se inyectó a dos conejos cuyo antisuero fue retirado y purificado en una columna de afinidad peptídica. Los ensayos de ELISA demonstraron que el anticueripo reconocía al antígeno peptídico. El anticuerpo fue posterioremente caracterizado mediante inmunohistoquímica en una panel de 22 tejidos periféricos normales entre los que se incluyó corazón, tres regiones de cerebro, y aorta. El patrón de inmunohistoquímica fue comparable a la distribución ya conocido de éste receptor en la literatura. Se realizaron técnicas de
inmunohistoquímica para co-localizar la expresión de
379-LP1248 y GFAP (Ab1 - Glial Fibrillary Acidic Protein - Bionova
MS-280-R7). Se utilizó ioduro de propidio para contrateñir
el ADN de los núcleos.
Se realizó la titulación del anticuerpo 379-LP1248 sin desenmascaramiento antigénico. Los mejores resultados se obtuvieron con diluciones entre 1/750 - 1/1000. Se utilizó un anticuerpo secundario de cabra anti conejo IgG(H+L) conjugado con Alexa Fluor 488 contra 379-LP1854 (Molecular Probes - Lab Net A-11008) que se empleó a una dilución de 1/100 y un anticuerpo secundaro de conejo anti ratón IgG(H+L) conjugado con Alexa Fluor 633 (Molecular Probes ~V Lab Net A-21063) a 1/100. El ioduro de propido se utilizó durante 5 minutos. Los estudios de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia fueron evaluados semi cuantitativamente en un microscopio de transmisión Axioplan/Axiophot 2 (Zeiss) siguiendo una escala de tinción (0 no tinción, 1 tinción débil, 2 tinción moderada, y 3 tinción intensa). Además se realizó una estudio de immunofluorescencía quantitativa mediante microscopía confocal con un equipo LSM 510 META (Zeiss) que disponía de tres lineas de laser de argon (458/488/514 nm 25 mW) y dos líneas de helio-neon (543 nm 1mW; 633nm, 5mW). Para éste segundo propósito capturamos imágenes de cada caso con tres magnificaciones ópticas diferentes. Siguiendo esta metodología realizamos una media de 7 imágenes por caso y fueron evaluadas para su análisis estadístico un total de 167 imágenes. Entre éstas imágenes inclimos siempre un mosaico de 3x3 imágenes o de 4x4 imágenes a 20x o 40x según el caso. De las 167 imágnes realizadas registramos las valores de la media y desviación estandar en relación con la intensidad de fluorescencia de cada uno de los canales, ingorando las intensidades por debajo del 4%. Según esto obtivimos tres valores numéricos diferenetes relacionados con la inmunoreactividad para el anticuerpo primario estudiado, GFAP y ioduro de propidio. El análisis estadístico se realizó mediante el paquete informático SPSS 12.0 para Windows. Para el análisis estadístico univariante se realizó el t-test y se calcuó el coeficiente de correlación de Pearson a la hora de buscar las relaciones entre dos variables. Además, se completó el esudio con un análisis de supervivencia según las curvas de Kaplan-Meier.
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En éste estudio hemo investigado 24 pacientes y 2 recurrencias que tuvieron lugar respectivamente a los tres y siete años después de realizado el diagnóstico. 12 casos fueron mujeres y 12 casos hombres. Los rangos de edades comprendieron entre los 17 y los 64 años (media 37.69 M:39.66 H). El tiempo de seguimiento de todos los pacientes superó los cinco años. 15 pacientes murieron (62,5%) (6M:9H), entre los cuales seis presentaron neoplasia recurrente. Solo un paciente murió antes de los diez meses después de realizado el diagnóstico. Entre los 9 casos que sobrevivieron a la neoplasia (6M:3H) 7 de ellos están libres de lesión (5M:2H). El grado histológico de acuerdo con la clasificación de la OMS incluyó 14 casos del grado II y 10 casos del grado III. Los detalles demográficos de la serie de casos estudiados se muestran en la Tabla 1.
El antibody 379-LP1248 tiñó
de forma constante tanto los oligodendrocitos interfasciculares como
los satélite en los tejidos procedentes de muestas humanas y
del cobaya (Figure 1). La tinción no se limitó al
citoplasma sino que se extendía también a las
prolongaciones finas de los procesos de los oligodendrocitos
relacionados con el neuropilo en la sustancia gris y en las
fibras mielínizadas de la sustancia blanca. Ocasionalmente algunos astrocitos
fibrosos mostraron una tinción débil con el anticuerpo
379-LP1248 según se confirmó mediante microscopía
confocal y su co-localización con GFAP. Sin embargo, la
población celular que predominantemente se teñía
se correspondío de forma constante con células que
morfológicamente eran oligodendrocitos
y que no mostraban co-localizción con GFAP.
La inmunohistoquímica mostró una tinción moderada en la mayor parte de las céluals tumorales en 12 (8 grado II/4 grado III) de 26 ODs y tinción intensa en 9 (6 grado II/3 grado III) (Figuras 2 y 3). Los test inferencia univariante comparando las medias de intensidad de fluorescencia, determinada mendiante LSM, dieron medias de 566.07 para el 379-LP1248, 243.62 para la GFAP y 537.92 para IP con un valor de la t de 24-150, 21.082 y 23.836 respectivamente. La correlación de Pearson para relaciones bivariante fue significativa con un valor de 0.01 para ADRA1A y GFAP. La construcción de las gráficas de supervivencia de Kaplan-Meier sugirió que los casos grado III (con una media de supervivencia de 36 meses y una mediana de 24 meses), tenían un peor pronóstico que los casos grado II (con una media de supervivencia y mediana de 72 meses). La media de supervivencia de los casos con una intensidad de fluorescencia baja para ADRA1A (150-498) fue de 66.43 meses (mediana de 96 meses) compareda con el tiempo medio de supervivencia de 54 meses (mediana 24 meses) que presentaron los casos con una alta intensidad de fluorescencia para ADRA1A (502-1107).
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Los oligodendrocitos, células
descritas por primera vez como el segundo componente de la glía
por Del Rio Hortega en 1921 (Del Rio-Hortega 1921), comparte con las
neuronas un mismo origen ectodérmico. Éstas se
reconocen por sus delicados y escasos procesos y algunas extensiones
citoplásmicas cortas poco ramificacidas. Su citoplasma es
escaso y muestan una forma esférica o de pera con una
apariencia descrita como de “huevo frito”. Sus núcleos son pequeños
y más densos que los de los astrocitos. Los oligodendrocitos,
clásicamente llamados "satélite" se
caracterizan por su localización en la sustancia gris
encontrándose próximos a neuronas de tamaño
grande y mediano.
En base a estudios morfológicos,
los oligodendrocitos se han relacionado principalemente con la
función de producir y mantener las fundas de mielina. Más
recientemente se ha demostrado que los oligodendrocitos podrían recibir señales de las neuronas vecinas y sintetizar
diferentes factores de crecimiento. La expresión de estos
factores de crecimiento estarían influenciados por las señales
neuronales (Du 2002). Publicaciones recientes nos han demostrado con
evidencias cada vez mayores que existen un complejo intercambio de
moléculas entre las células de la glia y las neuronas. En este trabajo hemos desmotrado una
inmunolocalización del receptor ADRA1A en oligodendrocitos en
tejido normal del SNC y en células neoplásicas en una
serie de casos de oligodendrogliomas humanos, mediante el uso de una
anticuerpo policlonal sensible a una única secuencia peptídica
de éste receptor. Además, mediante una aproximación
cuantitativa mediante inmunofluorescencia evaluada con microscopía
confocal hemos visto que los casos de ODs en los cuales existía
una mayor presencia de receptores, la supervivencia fue
significativamente menor en comparación con los casos que
presentaron un menor número de receptores. Los resultados no
significativos obtenidos mediante la fluorescencia emitida por el
ioduro de propidio, que podemos considerar como un control interno para
contrateñir el DNA de los núcleos, darían
consistencia a nuestro método. La secuencia usada para general el
anticuerpo consistía en un peptido que mostraba una identidad
del 100% entre el humano y el cerdo y una identidad del 94% entre
humano y cobaya. Los hallazgos obtenidos con éste anticuerpo
que selectivamente tiñeron los receptores ADRA1A tanto en
oligodendrocitos de humanos como de cobaya nos indicaría que
el cobaya podría ser considerado como un modelo animal óptimo
para poder estudiar en ellos distintas enfermedades de
desmielinización inducida. Los adrenoceptores fueron los primeros
neurorreceptores descritos en los astrocitos (Clark 1971), (Gilamn
1971), (Stone 1989) y más recientemente en los
oligodendrocitos (Khorchid 2002), (Assari 2003). Distintas lineas de
investigación han convergido en confirmar la hipótesis
de que las células de la glia serían una diana del
sistema central neuroadrenérgico. Además, algunas
evidencias indicarían que existe una subpoblación de
receptores alfa1-AD que potenciarían la actividad de la
adenilciclasa la cual se ha relacionionado con un incremento rápido
de la proliferación de éstas celulas de la glia. En el
mismo sentido se ha comprobado que un incremento de la actividad
mitogénica estaría activada por las proteinas kinasa
(MAPKs) que se han visto se encuentran incrementadas en las células
precursoras de los oligodendrocitos (OPC) después de
estimular los a1-adrenoceptores con norepinefrina en presencia de
propanolol, sugiriendo que los receptores ADRA1A activarían
las MAPK y que estos receptores podrían bloquearse con la toxina
pertussis (PTX). La activación de las MAPK por tanto podría
ocurrir a través de una proteina-G sensible a la PTX
(Khorchid 1999). Ésta ruta de transducción de señales,
en la que se activaría las MAPKs, debería de explorarse
convenientemente en los oligodendrogliomas.
Podemos considerar, de acuerdo con el
parecer de algunos autores al respecto, que existen dos tipos
histológicos principales dentro de los oligodendrogliomas. Las
formas tradicionales de OD que representarían el 80% de todos
los casos y un 20% de casos que podrían clasificarse como
“oligodendrogliomas inusuales”. Dentro del grupo de los ODs
“inusual” podríamos incluir aquellos que presentan una
actividad proliferativa incrementada. Una aproximación al problema de
la diversidad de los ODs seguida por algunos autores es el uso de
distintas técnicas de cultivos de tejidos. Mediante esta
técnica se ha podido poner en evidencia, in vitro, un patrón
de crecimiento característico en los oligodendrogliomas además
de comprobar una acitividad pulsatil de sus células
neoplásicas (Escalona 2004). Ésta actividad pulsatil
podría ser atribuida a la presencia de los
adrenoceptores en ésta célula dado que su presencia en
los miocitos cardiacos, también pulsátiles, se han
relacionado con la apertura de canales de calcio causada por los
compuestos adrenenalina-like. Inicialmente se describio que
los “oligodendrogliomas clásicos” carecían
de inmunoreactivadad para GFAP, aunque poco después algunos
autores confirmaron la posibilidad de que también los
oligodedrogliomas podrían expresarla. Actualmente se acepta que la expresión
de GFAP en los oligodendrogliomas corresponde no solo a astrocitos no
tumorales atrapados entre el tumor sino también a la expresión
de GFAP por los oligodendrocitos tumorales. Ésta expresión
comenzaría como un halo perinuclear que se extendería
por las prologanciones citoplásmicas hasta convertirse en
gruesas extensiones positivas para GFAP. Esta morfología es la
que se da en llamar “oligodendrogía gliofibrillar”
o “minigemistocitos” (Matyja 2001) (Matyja 2001b). Gran
parte de éstas células neoplásicas positivas
para GFAP en los ODs representarían un tipo de transición
celular a caballo entre la oligodendroglia y el linage astrocitario.
En éste sentido nosotros hemos podido demostrar en éste
trabajo que algunas células neoplasícas de los ODs
presentarían una colocalización entre GFAP y que el
receptor ADRA1A se observa invariablemente positivo en el linage
normal de oligodendrocitos. Del mismo modo, y en circunstancias
normales, algunos astrocitos fibrosos, en un número muy
reducido si se comparara con la población total de
astrocitaria, nos mostraron una co-expresion de ambos marcadores. Todavía no se conoce si existe
correlación entre la inmunorreactividad positiva para GFAP en
los ODs y su pronóstico. En algunos trabajos, ni la presencia
de oligodendrocitos gliofibrilares (GFOC) ni la de los
minigemistocitos son predictivos de la supervivencia de los
pacientes; aunque los pacientes con gemistocitos clásicos
tuvieron tiempos de supervivencia aproximadamente dos veces más
cortos que los pacientes que no presentaban éstas células
en sus tumores. El signo ominoso de la presencia de gemistocitos en
los ODs confirmaría algunos trabajos iniciales relacionados
con la significación pronóstica de éstas células
en los astrocitomas. Otra observación constante es el hallazgo
de "oligodendrocitos gliofibrilares" en las
tinciones con GFAP y de un patrón denominado "chicken
wire" de vasos tumorales observado mediante tinciones de HE y
que se ha relacionado significantivamente presente con mayor
frecuencia en los ODs de alto grado (Jagadha 1986), (Kross 1990),
(Schiffer 1997), (Dehghani 1998). En éste sentido, en nuestro trabajo hemos encontrado
que los ODs tendrían una correlación entre su
inmunorreactividad para GFAP y la muerte de los pacientes pero no
hemos podido confirmar su peor pronóstico en términos
de encontrar una menor media o mediana en la supervivencia al
realizar las curvas de Kaplan-Meier.
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Dos son las
conclusiones que se pueden desprender del trabajo aquí
presentado:
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Nuestra sincera gratitud y reconocimiento a Raquel Franco Rodriguez, Julio Paredes Gonzalez y Antonio Marquez Gallego por su ayuda y asistencia técnica.
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- José Miguel Sanz Anquela (10/10/2005 8:51:59)
- J. Ernesto Moro Rodríguez (10/11/2005 9:44:03)
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PDF.jpg)
fiogf49gjkf0dDatos demográficos de la serie de Oligodendrogliomas incluida en éste estudio.">
fiogf49gjkf0d* En rezón de la extensión incluimos en esta tabla únicamente los resultados de 26 las 167 imágenes evaluadas, correspondientes a las imágenes de mosaico obtenidas mediante microscopía confocal. adra1a_IH y adra1a_IF son los valores semicuenatitativos de inmunohistoquímica e immunofluorescencia según la intensidad de la tinción (0 no tinción, 1 tinción débil, 2 tinción moderada, y 3 tinción intensa ). adra1a_IHadra1a_CF, gfap_CF, y ip_CFadra1a_IH reflejan los valores cuantitativos obtenidos mediante inmunofluorescencia evaluada con microscopía confocal representando la media de intensidades de cada imagen.">
fiogf49gjkf0dInmunoreactividad para el alfaa 1a-adrenoceptor en el sistema nervioso central (SNC) normal humano y del cobaya. A.- Cápsula interna, oligodendrocitos interfasciculares, tejido humano x400. B.- Glioblastoma multiforme, positivo en los procesos de células de oligodendroglia atrapados entre las células neoplásicas, tejido humano x400. C.- Cortex, células de oligodendrocitos satélite y neuropilo de oligodendroglia, tejido humano 400. D.- Cerebelo , oligodendrocitos interfasciculares y neuropilo, tejido de cobaya x100.">
.JPG)
fiogf49gjkf0dA.- Oligodendroglioma grade II, H-E and B.- inmunohistoquímica para el alfa 1a-adrenoceptor. C.- Oligodendroglioma grade III, H-E and D.- inmunohistochemistry para el alfa 1a-adrenoceptor.">
fiogf49gjkf0dOligodendroglioma grade II, inmunofluorescencia para alfa 1a-adrenoceptor x400 (imagen izquierda) Expresión para ADRA1A (verde). Oligodendroglioma grade III, inmunofluorescencia para alfa 1a-adrenoceptor x630 oil (imagen derecha). Expresión para ADRA1A (verde), expresió para GFAP (rojo), ioduro de propidio (azul).">
fiogf49gjkf0dGráficas de los valores de las medias y DT para ADRA1A y GFAP y su relación con la surpervivencia and grado tumoral. Resultados obtenidos después de evaluar167 imágenes de microscopía confocal del total de los casos (26) y realizar su correspondiente morformetría cuantitativa.">
fiogf49gjkf0dCurvas de supervivencia Kaplan-Meier segun el grado de tumor (línea azul grade II, line verde grado III) e inmunoreactividad para alpha 1a-adrenoceptor (ADRA1A groupo 1 corresponde a los resultados cuantitativos mediante microscopía confocal con intensitidades entre 150-498, línea azul; y groupo 2 con intensidades entre 502-1107, línea verde con peor pronóstico).
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