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Introducción: La apolipoproteína D (apo D) es una glicoproteína que encuentra en el plasma humano asociada a las lipoproteínas de alta densidad (HDL). Como miembro de las lipocalinas, y sin conocer aún su ligando fisiológico, se ha sugerido que su función es la del transporte de pequeñas moléculas hidrofóbicas. Se ha demostrado la síntesis en una gran variedad de tejidos corporales incluido el sistema nervioso. En relación con el sistema nervioso, el aumento de la expresión de la apo D ha sido descrito en varias neuropatologías, sugiriéndose un importante papel para la apo D como posible marcador para el diagnóstico precoz de algunas enfermedades neurodegenerativas humanas, como el Alzheimer. La función exacta de la apo D no se conoce pero podría estar relacionada con en el almacenamiento, transporte y homeostasis de los lípidos cerebrales. En este trabajo nos hemos propuesto como objetivo el estudio inmunocitoquímico para la apo D en la sustancia negra de enfermos diagnosticados de Parkinson idiopático, comparándolo con controles normales de la misma edad.
Material y métodos: Se utilizaron muestras de la sustancia negra de 7 autopsias procedentes del Servicio de Anatomía Patológica del H.G.A., cuatro de individuos normales y tres de individuos con Parkinson. A partir de bloques de parafina se obtuvieron cortes de 10 mm, se realizó una inmunotinción para apo D, visualizada en microscopio de fluorescencia, mediante el fluorocromo Cy2.
Resultados: El estudio inmunocitoquímico de la sustancia negra de los individuos sanos mostró que las neuronas de esta área cerebral no son inmunorreactivas para la apolipoproteína D mientras que las células de glía acompañantes presentaban un leve marcaje. Cuando comparamos estos resultados con los enfermos de Parkinson se puede observar que no existen cambios significativos de marcaje, ni en las neuronas aparentemente intactas ni en aquellas con pérdida de melanina.
Conclusión: Se ha sugerido que el aumento regional de los niveles de apo D en el parénquima nervioso está relacionado con la neurodegeneración o posiblemente con la lesión o daño nervioso. Según algunos autores, la apo D sería una molécula neuroprotectora que se sintetizaría para a prevenir los resultados del estrés oxidativo en los lípidos celulares. Sin embargo, en este trabajo no encontramos relación entre la neurodegeneración en la enfermedad de Parkinson y el aumento en los niveles de apo D neuronal. Estos datos sugieren que las neuronas de la sustancia negra no son capaces de regular al alza la cantidad de apo D, lo que podría contribuir con el tiempo a la degeneración y muerte neuronal.

La apolipoproteína D (apo D) es una glicoproteína que pertenece a la extensa familia de las lipocalinas, proteínas transportadoras de pequeños ligandos hidrofóbicos. Entre los ligandos propuestos están el colesterol, el ácido araquidónico, los esteroides, la bilirrubina, etc (1). La apo D se sintetiza en los mamíferos en una gran variedad de tejidos y órganos, como el hígado, intestino, páncreas, riñón, placenta, glándulas adrenales, bazo y cerebro (2-5). Los lugares de mayor expresión encontrados en humanos han sido, junto con el hígado, el sistema nervioso central (SNC) y el sistema nervioso periférico (SNP). Las células que sintetizan apo D en condiciones normales son los fibroblastos a nivel sistémico y las células de glia en el sistema nervioso (2-7). Debido a la multitud de ligandos y a la gran variedad de lugares de síntesis, se cree que la apo D podría ser una proteína multiligando y multifunción, importante en la fisiología celular y dependiendo su función del lugar de síntesis.
A nivel sistémico y en asociación con la lecitin-colesterol-acetiltransferasa (LCAT), la apo D forma un complejo que actúa de forma activa retirando colesterol y sus ésteres de los tejidos periféricos y transportándolos por el plasma hasta el hígado para su catabolismo (8). También existen evidencias de la importancia del papel de la apo D en la redistribución lipídica en nervios lesionados, donde su expresión puede ser 500 veces la normal. Ésto sugiere que dicha proteína puede jugar un papel importante en el transporte y redistribución lipídica a nivel periférico (9).
En el sistema nervioso, existen evidencias de su sobreexpresión en determinadas áreas cerebrales afectadas por ciertas enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Niemman–Pick (ENP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la esquizofrenia, etc. (10-12). También en distintos tipos de lesiones, en diferentes áreas cerebrales, parece existir un aumento en la cantidad de células (neuronas o glia) en las que se localiza o sintetiza la apo D (13,14). Debido a esto se ha propuesto que la apo D podría ser una proteína de fase aguda o bien una proteína neuroprotectora sintetizada cuando la célula se siente dañada (13). En la actualidad, algunos trabajos sobre esquizofrenia y desordenes bipolares, cuya patogenia se tiende a explicar como un desorden lipídico provocado por el estrés oxidativo, proponen que la apo D actuaría como transportador y secuestrador de lípidos previniendo su peroxidación y protegiendo las propiedades de la membrana celular (12).
La enfermedad de Parkinson es una patología neurodegenerativa, que incluye entre sus características patológicas la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la zona compacta de la sustancia negra (SNc) junto con la existencia de inclusiones citoplasmáticas conocidas como cuerpos de Lewy (15). Aunque no existen pruebas directas de que sea el estrés oxidativo el responsable de la muerte de estas neuronas, varios trabajos permiten abrazar esta hipótesis (16). En la presunción de que esta premisa es cierta, y basándonos en el papel como posible antioxidante de la apo D en la esquizofrenia, nos planteamos el estudio de la relación entre la apo D y la enfermedad de Parkinson, mediante un estudio inmunohistoquímico de caracterización de la población neuronal de la sustancia negra en sujetos sanos normales y la comparación con los datos obtenidos en sujetos diagnosticados con esta enfermedad neurodegenerativa.

Las muestras proceden de necropsias realizadas por el Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Central de Asturias. Para este estudio fueron seleccionados dieciocho casos (sin distinción de sexo), de edades comprendidas entre los 39 y 87; doce de ellos no presentaban ningún tipo de patología nerviosa, mientras que seis casos habían sido diagnosticados de enfermedad de Parkinson.
Los bloques de mesencéfalo fueron fijados en formol, posteriormente embebidos en parafina (según el protocolo de rutina hospitalaria) y seccionados a 10 μm de grosor.
Sobre las secciones obtenidas se realizó una detección inmunohistoquímica para apo D (anticuerpo cedido por Dr. Carlos López-Otín). Para ello las secciones fueron desparafinada, rehidratadasb y tratadas con suero de bloqueo en PBS durante 30 minutos a Tª ambiente. Las secciones fueron incubadas durante toda la noche a 4ºC con el anticuerpo primario (1:2000 para la apo D). Tras varios lavados en PBS, las secciones fueron incubadas 30 minutos con un anticuerpo biotinizado (1:50) y posteriormente incubadas 30 minutos con estreptavidina marcada con el fluorocromo Flurolink Cy2 (Amersham, PA-42001). Se realizaron los test habituales de control de especificidad. Las fotografias se realizaron con una cámara digital Nikon (DN100) acoplada a un microscopio Nikon Eclipse E400.

El estudio inmunohistoquímico de la sustancia negra de los individuos control mostró que a excepción de alguna neurona aislada (menos del 2%), las neuronas melanizadas de esta zona no presentaban inmunorreactividad para la apolipoproteína D (Figuras 1 y 2). Como era de esperar, el número de neuronas y la cantidad de neuromelanina por célula en la sustancia negra disminuía con la edad del paciente. Sin embargo, el marcaje aparecía frecuentemente en la glia de la zona (Figura 3). El número de células de glia así como la intensidad de marcaje parecía incrementarse con la edad del individuo. Otros núcleos de la zona utilizados como control como el núcleo rojo (Figura 4), presentaban mayor intensidad de inmunotinción para apo D tanto en las neuronas como en las células de glia.
Los sujetos con EP estudiados mostraron pérdidas de moderadas a severas de neuronas y neuromelanina en la sustancia negra. La observación exhaustiva de la sustancia negra no presentó marcaje positivo para la apolipoproteína D, ni en las neuronas aparentemente intactas ni en aquellas con pérdida de neuromelanina (Figuras 5 y 6). La impresión de conjunto es que en la EP no existe un incremento de la intensidad ni número de células inmunoteñidas comparándolo con los sujetos control, en ninguna de las porciones de la sustancia negra: medial central o lateral.

El estudio inmunohistoquímico de la sustancia negra de pacientes con EP diagnosticada "postmortem" e individuos controles revela la falta de presencia de la apo D en las neuronas nigrales. No ocurre así con las células de glia acompañanates que presentan un marcaje directamente dependiente de la edad del individuo. Muchas otras estructuras del bulbo y mesencéfalo resultaron positivas para apo D tanto en controles como en sujetos con Parkinson y el marcaje se incrementó también con la edad.
La expresión del gen de la apo D ha sido asociada con la interrumpción de la proliferación celular (4) y también como respuesta no específica al daño y muerte celular (13). Sin embargo, no siempre ocurre así, pues en el SNP la sobreexpresion de apo D en el nervio ciático lesionado, está ligada al proceso de reparación y regeneración (9). Aquí, la presencia de apo D es un buen indicativo de que se está efectuando un secuestro y/o transporte activo de moléculas hidrofóbicas que serían necesarias para la reparación del tejido nervioso después de un daño celular.
Existe una creciente serie de evidencias que indican que la temprana alteración del metabolismo lipídico durante cualquier tipo de daño puede jugar un papel crítico en la muerte neuronal y en la actividad de las células gliales (17-20). Mecanismos como la excitotoxicidad y el estrés oxidativo producen un aumento del número de radicales libres en la célula. Una de las enzimas que se activa y aumenta es la fosfolipasa A2 que cataliza la descomposición de los fosfolípidos de membrana que de esta manera se copnvierten en moléculas perjudiciales para la neurona. Excesivo acúmulo de ácidos grasos libres, lisofosfolípidos y ácido lisofosfatídico se relacionó con la alteración de la respiración mitocondrial y la homeostasis neuronal, (21,22) induciendo necrosis y apoptosis en neuronas del hipocampo (23). El retraso en la recaptación de lipopartículas puede también ser altamente perjudicial para la supervivencia neuronal (24). Por lo tanto, cuando patológica o experimentalmente existe lesión neuronal la inmediata protección de la neurona, mediante el empaquetado y la recaptura de lípidos, puede ser esencial para disminuir el efecto letal de la excitotoxicidad y del estrés oxidativo. La captación de lípidos libres potencialmente dañinos (como el ácido araquidónico) ha sido una de las funciones postuladas para la apo D dentro del mantenimiento de la homeostasis neuronal, debido a su capacidad para unir moléculas hidrofóbicas (25).
Gran cantidad de trabajos avalan la existencia de un alto índice de peroxidación lipídica en las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra de enfermos de Parkinson, probablemente debido a procesos de estrés oxidativo (26, 27). Este hecho comprometería seriamente muchas funciones importantes de membrana como la fosforilación oxidativa, señales de traducción, transporte de metabolitos, etc... Sin embargo, en nuestro estudio no hemos observado un aumento de la presencia de la apolipoproteína D dentro del citoplasma neuronal, y además, la respuesta de síntesis de apo D por la glia no parece ser diferente de la que ocurre normal que ocurre durante el proceso de envejecimiento en otras áreas cerebrales (28).
En la esquizofrenia, han sido descritos cambios en la localización y síntesis de apo D posiblemente debidos al tratamiento crónico con clozapina (29). Contemplamos pues la posibilidad de que el tratamiento de los pacientes con levodopa pudiese influir en los resultados. Sin embargo, aunque existen diferencias en dosis y tiempo de tratamiento con la levodopa, este hecho no parece tener ninguna influencia sobre la presencia de apo D en las neuronas.
Estos datos nos han resultado llamativos, puesto que si la apolipoproteína D se comporta como marcador del daño celular en lesiones del sistema nervioso y en algunas enfermedades neurodegenerativas, los resultados esperados deberían de mostrar algún tipo de cambio en la localización o síntesis en la población neuronal dopaminérgica de la sustancia negra. Por tanto, es difícil formular cualquier tipo de conclusión, sin acometer antes más estudios de este tipo utilizando otro tipo de marcadores de daño celular como las proteínas de choque térmico, la apolipoproteina J, etc.... Debemos de contemplar también el hecho de que no todas las poblaciones neuronales se comportan homogéneamente y que la regulación del gen de la apo D no es sencilla y depende de la modulación de gran cantidad de factores que no ocurren en este tipo neuronal en degeneración. Por último la cantidad de apolipoproteína D de glia del núcleo no ha sido exhaustivamente estudiada y es posible que su papel sea igualmente importante para la supervivencia neuronal.

(1) Rassart É, Bedirian A, Do Carmo S, Guinard O, Sirois J, Terrisse L, Milne R. Apolipoprotein D. Biochim Biophys Acta 2000; 1482: 185-198.
(2) Smith KM, Lawn RM, Wilcox JN. Cellular localization of apolipoprotein D and lecithin: cholesterol acyltransferase mRNA in rhesus monkey tissues by in situ hybridization. J Lipids Res 1990; 31: 995-1004.
(3) Boyles JK, Notterpek LM, Wardell MR, Rall SC Jr. Identification, characterization and tissue distribution of apolipoprotein D in the rat. J Lipids Res 1990; 31: 2057-2065.
(4) Provost PR, Weech PK, Tremblay NM, Marcel YL, Rassart E. Molecular characterization and differential mRNA tissue distribution of rabbit apolipoprotein D. J Lipids Res 1990; 31: 2057-2065.
(5) Séguin D, Deforges M, Rassart E. Molecular characterization and differential mRNA tissue distribution of mouse apolipoprotein D. Mol Brain Res 1995; 30: 242-250.
(6) Patel SC, Asotra KA, Patel YC, McConathy WJ, Patel RC, Suresh S. Astrocytes synthesize and secrete the lipophilic ligand carrier apolipoprotein D. Neuro Report 1995; 6: 653-657.
(7) Navarro A, Tolivia J, Astudillo A, del Valle E. Pattern of apolipoprotein D immunoreactivity in human brain. Neurosci Lett 1998, 254: 17-20.
(8) Glomset JA, Norum KR. The metabolic role of lecithin-cholesterol acyltransferase: perspectives from pathology. Adv Lipid Res 1973; 11: 1-65.
(9) Spreyer P, Schaal H, Kuhn G, Rothe T, Unterbeck A, Olek K, Müller HW. Regeneration-associated high level expression of apolipoprotein D mRNA in endoneurial fibroblast of peripheral nerve. Eur Mol Biol Org J 1990; 9: 2479-2484.
(10) Suresh, S.; Yan, Z.; Patel, RC.; Patel, YC.; Patel, SC. Cellular cholesterol storage in the Niemann-Pick disease type C Mouse is associated with increased expression and defective processing of apolipoprotein D. J. Neurochem., (1998), 70: 242-251.
(11) Terrisse L, Poirier J, Bertrand P, Merched A, Visvikis S, Siest G, Milne R, Rassart É.(1998) Increased levels of apolipoprotein D in cerebrospinal fluid and hippocampus of Alzheimer’s patients. J Neurochem 71: 1643-1650.
(12) Thomas EA, Dean B, Pavey G, Sutcliffe JG. Increased CNS levels of apolipoprotein D in schizophrenic and bipolar subjects: implications for the pathophysiology of psychiatric disorders. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 2001; 98: 4066-4071.
(13) Ong WY, He Y, Suresh S, Patel SC. Differential expression of apolipoprotein D and apolipoprotein E in the kainic acid-lesioned rat hippocampus. Neuroscience 1997; 79: 359-67.
(14) Terrise L, Séguin D, Bertrand P, Poirier J, Milne R, Rassart E. Modulation of apolipoprotein D and apolipoprotein E expression in rat hippocampus after entorhinal cortex lesion. Mol Brain Res. 1999; 70: 26-35.
(15) Ollanow CW, Youdim MB. Neurodegeneration and neuroprotection in Parkinson´s disease. New York: Academic Press, 1996.
(16) Schapira AH. Pathogenesis of Parkinson´s disease. Ballieres Clin Neurol 1997; 6: 15-36.
(17) Relton, JK; Strijbos, PJ; Cooper, AL; Rothwell, NJ. 1993. Dietary N-3 fatty acids inhibit ischaemic and excitotoxic brain damage in the rat.
(18) Bazan, NG; Rodríguez de Turoco, EB; Allang, G. Mediators of injury in neurotrauma: intracellular signal transduction and gene expression. J. Neurotrauma 1995; 12: 791-814.
(19) Shing, JK, Dasgupta, A., Adayev, T., Shahmehdi, SA., Hammond, D., Banerjee, P. Apoptosis is associated with an increase in saturated fatty acid containing phospholipids in neuronal cell line HN2-5. Biochem Biophys Acta 1996; 1304: 171-178.
(20) Kruman, I; Bruce-Keller, AJ; Bredesen, D; Waeg, G; Mattson, MP. Evidence that 4-hydroxynomenal mediates oxidate stress-induced neuronal apoptosis. J Neurosci 1997; 17: 5089-5100.
(21)Chapman, A., Ingvar, M., Siejo, BK. Free fatty acid in brain in bicuculline-induced SE. Acta Physiol Scand 1980; 110: 335-336.
(22) Zhang, JP., Sun, GY. Free fatty acid, neutral glycerides and phosphoglycerides in transient focal cerebral ischemia. J. Neurochem 1995; 64: 1688-1695.
(23) Holtsberg, FW; Steiner, MR; Keller, JN; Marck, RJ; Mattson, MP; Steiner, SM. Lysophosphatidic acid induces necrosis and apoptosis in hippocampal neurons. J Neurochem 1998; 70: 66-76.
(24) Kivatinitz, SC; Pelsman, MA; Alonso, AC; Bagatolli, L; Quiroga, S. High-density lipoprotein aggregated by oxidation induces degeneration of neuronal cells. J Neurochem 1997; 69: 2102-2114.
(25) Thomas EA, George RC, Sutcliffe JG. Apolipoprotein D modulates arachidonic acid signaling in cultured cells: implications for psychiatric disorders. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 2003; 69(6):421-7.
(26) Yoritaka A, Hattori N, Mori H, Kato K, Mizuno Y. An immunohistochemical study on manganese superoxide dismutase in Parkinson's disease. J Neurol Sci 1997; 148(2):181-6.
(27) Ebadi M, Srinivasan SK, Baxi MD. Oxidative stress and antioxidant therapy in Parkinson's disease. Prog Neurobiol 1996;48(1):1-19.
(28) Kalman J, McConathy W, Araoz C, Kasa P, Lacko AG. Apolipoprotein D in the aging brain and in Alzheimer's dementia. Neurol Res 2000; 22(4):330-6.
(29) Khan MM, Parikh VV, Mahadik SP. Antipsychotic drugs differentially modulate apolipoprotein D in rat brain. J Neurochem 2003;86(5):1089-