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INTRODUCCIÓN : Los receptores Alfa-1-adrenérgicos (ADRA-1A) son moléculas transmembrana asociadas a la proteína G que median acciones conocidas en el sistema nervioso simpático al ligarse con catecolamina, epinefrina o norepinefrina. Estudios realizados por Hirasawa et al. (1993) mediante RT-PCR demostraron transcripción de ADRA-1A en varios tejidos como el corazón, cerebro, hígado y próstata estando ausente sin embargo en riñón, pulmón, glándula adrenal, aorta y pituitaria. MATERIAL Y MÉTODOS : En el presente trabajo realizamos un estudio inmunohistoquímico mediante un anticuerpo policlonal ( LSID 379 ) producido por LifeSpan Biosciencies, Seattle (WA), que reconoce específicamente ADRA-1A, habiendo determinando su inmunorreactividad en muestras procedentes de tejido nervioso normal humano y de cerdo. Se han estudiado las siguientes localizaciones: Corteza cerebral del lóbulo frontal, surco calcarino, cerebelo, médula espinal en cortes transversales desde la región cervical a lumbar y nervio periférico. Este trabajo se ha completado con un estudio de inmunofluorescencia y microscopía confocal para co-localizar LSID 379, HUB (Anti human neural protein Huc/Hub - Lab Net TO-21272), GFAP (Ab1 - Glial Fibrillary Acidic Protein - Bionova MS-280-R7) y Tpro 3 (Topro 3 Iodade -LabNet T-3605). Simultáneamente se han estudiado también 5 casos de Oligodendrogliomas para caracterizar su inmunorreactividad en esta neoplasia. RESULTADOS Y CONCLUSIONES : Los resultados preliminares nos permiten afirmar que existe una particular expresión de éste anticuerpo en oligodendrocitos de tejido nervioso procedente de la especie humana, no así en cerdo. Expresión que parece constante también, e intensificada si cabe, en sus neoplasias asociadas.

Las células gliales constituyen la mayor parte de las células presentes en el sistema nervioso, sin embargo, hasta fechas relativamente recientes no se ha iniciado el abordaje del estudio de su participación en la fisiología cerebral y las consecuencias de su disfunción. Entre ellas, los oligodendrocitos son células que se hallan en el sistema nervioso central, cuya misión es mielinizar los axones del mismo, mediante la extensión de prolongaciones que los envuelven. Existen además oligodendrocitos satélite, células perineuronales que parecen participar en el mantenimiento del entorno bioquímico neuronal y se ha postulado su participación en el mantenimiento neuronal como células proveedoras de factores de crecimiento.

Existen también cada vez más evidencias de la relación entre neuronas y oligodendrocitos vía neurotransmisores. En éste sentido, los adrenoreceptores han sido los primeros neuroreceptores descritos en las células gliales. Entre ellos, los receptores alfa-1 adrenérgicos (ADRA-1A) representan una familia heterogénea de moléculas de membrana que median la acción de las catecolaminas (adrenalina, noradrenalina y dopamina) sobre la cadena de segundos mensajeros inducida por proteínas G. Divididos en tres subtipos, alfa-1A (inicalmente denominado 1C), alfa-1B y alfa-1D con diferente afinidad por cada uno de sus neurotransmisores, median acciones bien conocidas en sistema nervioso simpático (1) a (6).

"Hirasawa et al. (1993) (7) clonaron el ADRA-1A, de una biblioteca de cDNA procedente de próstata. El análisis de su secuencia determinó que la proteína ADRA-1A, formada por 466 aminoácidos, tenía una homología del 96% con respecto a la proteína bovina y contenía 3 sitios de glicosilación unidos al extremo N terminal, 7 dominios transmembrana y un sitio de fosforilación en su extremo C terminal. Los análisis posteriores mediante RT-PCR han detectado la transcripción de ADRA-1A en corazón, cerebro, hígado, y próstata, estando ausente en riñón, pulmón, glándula suprarrenal, aorta, y glándula pituitaria. Seguidamente caracterizaron 2 variantes de ADRA1A que codificaban proteínas de 499 y 429 aminoácidos con secuencias que diferían en el extremo C-terminal. Los análisis mediante RT-PCR han indicado que existe una coexpresión con la isoforma previamente identificada en corazón, hígado, cerebro y cerebelo (8). Por otra parte, Weinberg et al. (1994) (9) han clonado también ADRA1A determinando que la región N-terminal (18 aminoácidos) es más corta que la de ADRA-1D (88 aminoácidos) o ADRA-1B (38 aminoácidos). El análisis funcional ha demostrado que las tres isoformas tienen propiedades similares en cuanto a su relación con los ligandos. Finalmente, Chang et al. (1998) (10) han identificado una cuarta isoforma del ADRA-1A que codifica una proteína de 455 amino acidos. Los análisis cuantitativos mediante PCR sugieren que esta isoforma podría expresarse de forma más intensa en la próstata que las otras referidas anteriormente". (1)

La presencia de estos neuroreceptores en el sistema nervioso central se explicaría al participar en la comunicación entre neuronas y células gliales. Así, se ha confirmado que los oligodendrocitos in vitro expresan los distintos subtipos de ADRA-1A, especialmente en su variante alfa-1A, hecho directamente relacionado con su grado de diferenciación y que provoca un aumento en la concentración intracelular de calcio mediante la estimulación del fosfoinositol (11), (12).

En el presente trabajo realizamos un estudio inmunohistoquímico mediante un anticuerpo policlonal ( LSID 379 ) producido por LifeSpan Biosciencies, Seattle (WA), que reconoce específicamente ADRA-1A, habiendo determinando su inmunorreactividad en muestras procedentes de tejido nervioso normal humano y de cerdo. Se han estudiado las siguientes localizaciones: Corteza cerebral del lóbulo frontal, surco calcarino, cerebelo y médula espinal en cortes transversales desde la región cervical a la lumbar y nervio periférico. Este trabajo se ha completado con un estudio de inmunofluorescencia y microscopía confocal para co-localizar LSID 379, HUB (Anti human neural protein Huc/Hub - Lab Net TO-21272), GFAP (Ab1 - Glial Fibrillary Acidic Protein - Bionova MS-280-R7) y Tpro 3 (Topro 3 Iodade -LabNet T-3605). Simultáneamente se han estudiado también 5 casos de Oligodendrogliomas para caracterizar su inmunorreactividad en esta neoplasia.

Se realizó una titulación para el anticuerpo LSID-379 con las siguientes diluciones 1/50, 1/200, 1/500, 1/750, 1/1000, 1/2000, 1/4000 y 1/6000 (sin desenmascaramiento) obteniendo buenos resultados con diluciones entre 1/750 - 1/1000. Finalmente establecimos el siguiente protocolo de inmunofluorescencia LSID-379 1/500 en incubación toda la noche a 4º y Anti-IgG1 (antirabbit)- Alexa 488 1/100 en incubación durante 3 horas. Para la realización de la inmunofluorescencia con GFAP RU se incubó toda la noche a 4º y Anti-IgG1(anti-mouse)- Alexa 633 1/100 durante 3 horas.

Se ha comprobado que exite inmunorreactividad para ADRA-1A de forma constante en los oligodendrocitos tanto interfasciculares Figura_1 como satélites Figura_2, positividad que no queda limitada al soma celular sino que se extiende a sus prologaciones en el neuropilo. Esta circunstancia se ha podido constatar cuando la incidencia del corte puso en evidencia sus procesos Figura_3 y Figura_4. Ocasionalmente también se han podido observar algunos astrocitos fibrosos con inmuorreactividad para ADRA-1A en los que se confirmó mediante microscopía confocal la co-localización de éstos receptores con la proteína estructural PGFA Figura_5_A.

No hemos observado diferencias de inmunorreactividad relacionadas con las localizaciones estudiadas: Corteza cerebral del lóbulo frontal, surco calcarino, cerebelo y médula espinal en cortes transversales desde la región cervical a lumbar.

Al estudiar el tejido nervioso procedente de cerdo ( Sus scrofa domestica, cerdo doméstico ), en las mismas localizaciones y condiciones de inmunotinción que las anteriores, no se ha visto inmuorreactividad para ADRA-1A identificable mediante el anticuerpo policlonal LSID 379.

Analizados 5 Oligodendrogliomas procedentes de archivo con una antiguedad menor a los cinco años, se ha constatado inmunorreactivadad intensa (+++) en 3 de 5 casos Figura_6 y Figura_7_A.

Los oligodendrocitos, descritos por primera vez por Del Rio Hortega en 1921 (13), comparten con las neuronas un mismo origen ectodérmico y se reconocen por sus escasas y finas prolongaciones de trayecto corto. Sus cuerpos celulares suelen ser cuadrangulares, esféricos o piriformes y sus núcleos son algo más pequeños y redondos que los de los astrocitos, si bien tienen mayor capacidad tintorial mostrándose hipercromáticos. Por su localización se han descrito tres variedades de oligodendrocitos: 1) Células perineurales satélites, presentes en la sustancia gris en relación estrecha con los somas y las dendritas de las neuronas. Éste tipo de células suele presentar un núcleo un poco más grande y pleomorfo que el de los oligodendrocitos presentes en la sustancia blanca. 2) Células interfasciculares, que se identifican en la sustancia blanca generalmente siguiendo una distribución "fascicular" o en hilera entre las fibras mielínicas. Éstos oligodendrocitos son muy numerosos durante el desarrollo, disminuyendo su presencia a medida que progresa la mielinización. Una vez concluida ésta, apenas quedan como reconocibles sus núcleos siendo sus prolongaciones difíciles de distinguir en los tejidos procedentes de adultos. 3) Células perivasculares, descritas por Cammermeyer en 1966 y Luse en 1968, son difíciles de identificar y de las que se describe que sus delicadas prolongaciones se extienden como pies terminales en los vasos sanguíneos locales (14).

Son varias las funciones que se han atribuido a oligodendrocitos: desde la más conocida formación de la vaina de mielina de los axones hasta su intervención como intermediario en el metabolismo neuronal. También se les ha atribuido una función como aislantes para prevenir la información cruzada entre los elementos neuronales o relacionados con la modulación de la actividad nerviosa ya que desde hace tiempo se ha constatado que los potenciales de reposo de las células gliales pueden ser influidos por los impulsos nerviosos que ocurren en los territorios vecinos. Recientemente también se les considera una fuente de factores de crecimiento con posible acción autocrina (15).

En los últimos años se han ido acumulando las evidencias que confirmarían que existe una compleja comunicación molecular entre las neuronas y las células de la glia. Así, los adrenoreceptores han sido los primeros neuroreceptores descritos en las celulas gliales, primero al identificarse el efecto de las catecolaminas sobre cultivos de astrocitos (16) a (19) y luego al constatarse su presencia tanto en astrocitos (11) como en oligodendrocitos (12).

En cuanto a las posibles implicaciones clínicas y farmacológicas, los ADRA-1A se han relacionado con en el mecanismo de acción de los antidepresivos. En éste sentido Nalepa I. y col. han determinado que el tratamiento repetido con imipramina así como también mediante shock eléctrico ocasiona un incremento de los niveles de RNAm de ADRA-1A en la corteza prefrontal de las ratas lo que les sugiere que el subtipo alfa1-adrenoceptor está relacionado específicamente con el mecanismo de acción de los tratamientos clínicos antidepresivos (21).

Con respecto a la comunicación entre las neuronas y los oligodendrocitos, desde los trabajos de Barrer y Raff (1993) conocemos que la proliferación de los oligodendrocitos progenitores depende de la actividad neuronal y que puede ser reemplazada cuando se realiza un aporte exógeno del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (22). Además, para Demerens y col. la supervivencia de los oligodendrocitos dependería de la acción de los axones y su mielinización por los oligodendrocitos estaría relacionada con la actividad eléctrica de aquellos (23). En el trabajo ya mencionado de Khorchid A (2002) se sugiere que son los neurotransmisores y los neuropéptidos, cuya liberación podría estar desencadenada por la acción de los axones, desempeñarían un papel importante en el desarrollo de los oligodendrocitos (12). Teniendo en consideración éstas evidencias, resultaría de gran interés el poder determinar el estado de inmunorreactividad los receptores ADRA-1A en tejidos procedentes de pacientes con enfermedades desmielinizantes adquiridas (p.e esclerosis múltiple) o congénitas (leucodistrofias).

Los hallazgos de Khorchid y col. sugieren también que los receptores de neurotransmisores estarían relacionados con diferentes roles a desempeñar por los progenitores de los oligodendrocitos y que su presencia variaría durante su desarrollo; a lo que se sumaría un incremento en la expresión de c-fos (24) como resultado de la transducción de señal iniciada por la activación de los estímulos NA sobre la ruta de las MAPK. Por esta razón se hace necesario también explorar qué implicación pudiera existir en los procesos neoplásicos derivados de las diferentes estirpes gliales y la mencionada ruta de transducción. En éste sentido pensamos que un abordaje como el planteado en éste trabajo resultaría óptimo dado que pueden ponerse en relación tanto los hallazgos moleculares como los morforlógicos, hecho que hasta la fecha resulta inédito en la literatura. Por ésta razón y dado que nuestros hallazgos confirman de forma constante tanto la expresión de ADRA-1A en el SNC como en los Oligodendrogliomas, pensamos que sería necesario ampliar el número de casos a estudio y acabar de concluir qué relación existe entre la presencia de los mencionados receptores con la evolución de éstas neoplasias.


Agradecimiento :
Queremos expresar nuestro agradecimiento a Dña. Raquél Franco Rodríguez por su inestimable asistencia técnica.

1 Database Institute for Chemical Research, Kyoto University. OMIM 104221 Contributors: Victor A. McKusick. Paul J. Converse. Copyright © 1966-2004 Johns Hopkins University.

2 GeneCard for gene ADRA1A - Weizmann Institute of Science GC08M026627

3 EMBL Bioinformatic Harvester Q96RE8 - Adrenergic receptor alpha-1a

4 Mouse Genome Informatics - The Jackson Laboratory MGI:104773

5 Rat Genome Database - Medical College of Wisconsin. RGD ID: 2055

6 CancerGene - Centre National de la Recherche Scientifique, Institute Gustave-Roussy. Laboratoire de Génétique Oncologique, Groupe de Bioinformatique CG_ID 2283

7 Hirasawa, A.; Horie, K.; Tanaka, T.; Takagaki, K.; Murai, M.; Yano, J.; Tsujimoto, G. Cloning, functional expression and tissue distribution of human cDNA for the alpha-1C-adrenergic receptor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 902-909, 1993. PubMed ID : 8396931

8 Hirasawa, A.; Shibata, K.; Horie, K.; Takei, Y.; Obika, K.; Tanaka, T.; Muramoto, N.; Takagaki, K.; Yano, J.; Tsujimoto, G. Cloning, functional expression and tissue distribution of human alpha-1C-adrenoceptor splice variants. FEBS Lett. 363: 256-260, 1995. PubMed ID : 7737411

9 Weinberg, D. H.; Trivedi, P.; Tan, C. P.; Mitra, S.; Perkins-Barrow, A.; Borkowski, D.; Strader, C. D.; Bayne, M. Cloning, expression and characterization of human alpha adrenergic receptors alpha-1A, alpha-1B, and alpha-1C. Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 1296-1304, 1994. PubMed ID : 8024574

10 Chang, D. J.; Chang, T. K.; Yamanishi, S. S.; Salazar, F. H. R.; Kosaka, A. H.; Khare, R.; Bhakta, S.; Jasper, J. R.; Shieh, I.-S.; Lesnick, J. D.; Ford, A. P. D. W.; Daniels, D. V.; Eglen, R. M.; Clarke, D. E.; Bach, C.; Chan, H. W. Molecular cloning, genomic characterization and expression of novel human alpha-1A-adrenoceptor isoforms. FEBS Lett. 422: 279-283, 1998. PubMed ID : 9490024

11 Assari T, Cox S, Munday MR, Pearce B. Regulation of alpha(1)-adrenoceptor-linked phosphoinositide metabolism in cultured glia: involvement of protein phosphatases and kinases. Cell Signal 15 (4): 403-12, 2003. PubMed ID : 12618215

12 Khorchid A, Cui Q, Molina-Holgado E, Almazan G. Developmental regulation of alpha 1A-adrenoceptor function in rat brain oligodendrocyte cultures. Neuropharmacology 42 (5): 685-96, 2002. PubMed ID : 11985827

13 Del Rio-Hortega, P. Estudios sobre la neuroglia. La glía de escasas radiaciones(oligodendroglía). Bo R Soc Espan Hist Nat; 21-63-92, 1921.

14 Cammermeyer, J. Morphologic distintions betwwen oligodendrocytes and microglia cells in the rabit cerebral cortex. Am J Anat; 118:227, 1966.

15 Du Y, Dreyfys F.C. Oligodendrocytes as provider of growth factors. J Neurosc Res 68:647-654, 2002. PubMed ID:12111826

16 Clark RB, Perkins JB. Regulation of adenosine 3`,5`-cyclic monophosphate concentration in cultured human astrocytoma cells by catecholamines and histamine. Proc Nat Acad Sci USA 68:2757-2760, 1971. PubMed ID:4330940

17 Gilamn AG, Nirenberg ;. Effect of catecholamines on the adenosine 3',5'-cyclin monophosphate concentrations of clonal satellite cells of neurons. Proc Natl Acad Sci USA 68:2165-2168, 1971. PubMed ID:4332686

18 Stone EA, Ariano MA. Are glial cells targets of the central noradrenergic system? A review of the evidence. Brain Res Brain Res Rev 14 (4): 297-309, 1989. PubMed ID : 2560410

19 Agullo L, Garcia A. Characterization of noradrenaline-stimulated cyclic GMP formation in brain astrocytes in culture. Biochem J 288 ( Pt 2): 619-24, 1992. PubMed ID : 1334410

20 Kulik A, Haentzsch A, Luckermann M, Reichelt W, Ballanyi K. Neuron-glia signaling via alpha(1) adrenoceptor-mediated Ca(2+) release in Bergmann glial cells in situ. J Neurosci 19 (19): 8401-8, 1999. PubMed ID : 10493741

21 Nalepa I, Kreiner G, Kowalska M, Sanak M, Zelek-Molik A, Vetulani J. Repeated imipramine and electroconvulsive shock increase alpha 1A-adrenoceptor mRNA level in rat prefrontal cortex. Eur J Pharmacol 2002 May 31;444(3):151-9. PubMed ID : 12063075

22 Barrer BA, Raff MC. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature 361, 258-260, 1993. PubMed ID:8093806

23 Demerens C., Stankoff B, Logak M, Anglade P, Allinquant B, Couranud F, Zale B, Lubertzki C. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity, Proc Nat Acad Sci USA 93:9887-9872, 1996. PubMed ID:8790426

24 Khorchid A, Larocca JN, Almazan G. Characterization of the signal transduction pathways mediating noradrenaline-stimulated MAPK activation of c-fos expression in oligodendrocyte progenitors. J Neurosci Res 58; 765-778, 1999. PubMed ID:10583908