VI Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica
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Biopsias de nervio periférico. Experiencia en el Instituto de Neurología y Neurocirugía de La Habana

Téc. María Xiomara Gil Gil , Dr. Joaquín Galarraga Inza , Dra. Rosa María Coro Antich y Dr. Héctor Gómez Suárez

Laboratorio de Neuropatología
Instituto de Neurología y Neurocirugía, La Habana, Cuba
calle 29 y D 345 Vedado
10400c Ciudad Habana

Cuba
 Resumen
En este trabajo se revisan algunas técnicas y principios fundamentales en la coloración de la mielina: la técnica de Weigert-Pal y la de Luxol Fast Blue combinada con Crezyl Violeta. Se presentan las modificaciones introducidas por Galarraga a la Tricrómica de Masson para tejido conectivo y se repasa la técnica de Glees Marsland para axones. Se presenta el procedimiento de trabajo que se sigue en este laboratorio con los nervios periféricos.
Los objetivos de este trabajo son: Difundir estas técnicas, que se pueden realizar con recursos mínimos, y resaltar la importancia de los distintos tipos de fijadores que se usan para los nervios periféricos cuando se van a incluir en parafina.
 Introducción
En el laboratorio de Anatomía Patológica del Instituto de Neurología y Neurocirugía se realizan anualmente un promedio de 100 biopsias de nervios periféricos, tanto de la institución como de otros centros del país.
En este trabajo se revisan algunas técnicas y principios fundamentales en la coloración de la mielina: la técnica de Weigert-Pal. Se presentan las modificaciones introducidas por Galarraga a la Tricrómica de Masson para tejido conectivo y se repasa la técnica de Glees Marsland para axones. Se presenta el procedimiento de trabajo que se sigue en este laboratorio con los nervios periféricos.
Objetivos
- Difundir estas técnicas, que se pueden realizar con recursos mínimos.
- Resaltar la importancia de los distintos tipos de fijadores que se usan para los nervios periféricos cuando se van a incluir en parafina.
 Material y Métodos
Las técnicas que se usan en el procesamiento de los nervios periféricos en nuestro laboratorio son:
1. Técnica de Weigert-Pal
2. Glees - Marsland
3. Tricrómica de Masson modificada por Galarraga
4. Luxol Fast Blue combinada con Crezyl Violeta
5. Fiti Faraco
6. Hematoxilina – Eosina

Se describen las 3 primeras técnicas por ser las más específicas en el procesamiento de los nervios periféricos.
 Resultados
DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS QUE SE USAN EN NUESTRO LABORATORIO

1.Técnica de Weigert-Pal

Objetivo de esta técnica: Destacar los anillos de mielina (1)
Fijación: Líquido de Flemming 24 horas y lavado en agua corriente 24 horas más, antes de pasar al procesador de tejidos
Inclusión: Parafina
Corte: 10 y 12 µ
La mielina es una sustancia lipo-proteica compuesta por esfingomielina, celebrósidos, gangliósidos, colesterol, etc. Tanto en el sistema nervioso central como en el periférico, muchos axones están recubiertos por una vaina de mielina. La presencia de esta sustancia determina la fisiología de estos nervios.
La importancia del estudio de la mielina en Neuropatología radica en que muchas enfermedades neurológicas cursan con afectaciones de la mielina.
Esta técnica se usa fundamentalmente para cortes transversales de nervio periférico porque permite valorar la densidad de fibras mielínicas en los fascículos tanto visualmente, como por morfometría. Además, en este laboratorio se ha estandarizado un procedimiento de morfometría que permite obtener la curva de distribución de los diámetros de las fibras mielínicas, con lo cual se pueden establecer correlaciones morfo-fisiológicas (2)

Soluciones:

HEMATOXILINA WEIGERT-PAL
Hematoxilina al 10% (alcohólica)............... 5 ml
Agua destilada ....................................... 50 ml
Carbonato de Litio (saturado)................... 1,5 ml

CELOIDINA
Celoidina .............................................. 1 ml
Alcohol-éter a partes iguales................... 50 ml

FIJADOR DE FLEMMING
Solución de ácido crómico al 1%................ 15 ml
Solución de Tetróxido de Osmio al 2%........ 4 ml (guardada a 4ºC)
Ácido acético glacial................................ 1 ml

DIFERENCIADOR DE PAL
Ácido oxálico al 1% a partes iguales con
Sulfato de Potasio al 1%

PERMANGANATO DE POTASIO AL 0,25%
Permanganato de Potasio.......................... 0,25 g
Agua destilada .................................. 100 ml

Procesamiento de las láminas

· Desparafinar hasta alcohol absoluto
· Sumergir en frasco con celoidina, 1 minuto
· Secar, 1 minuto
· Alcohol al 80%, 5 minutos
· Agua destilada, lavar
· Hematoxilina de Weigert-Pal, 24 horas
· Agua corriente, lavar varios minutos
· Agua destilada, lavar
· Oxidar con Permanganato de Potasio al 0,25%, 5 minutos
· Agua corriente, lavar varios minutos
· Diferenciador de Pal, 1 minuto. Es importante revisar al microscopio pues si está sobreteñido se le da otro pase por el Permanganato de Potasio. En este paso también se revisan los anillos de mielina.
· Deshidratar. Se deja en el primer alcohol después de la Eosina donde el tejido toma un color de fondo rosado y resaltan los anillos de mielina
· Aclarar con 3 ó 4 xiloles
· Colocar el cubreobjetos con Bálsamo de Canadá

Resultado Figura_1
Anillos de mielina................... negro
Fondo.................................. rosado

2. Método de Glees - Marsland

Objetivo de esta técnica: Destacar los axones (3)
Fijación: Formol 10%
Inclusión: Parafina
Corte: 6 a 8 µ

Esta técnica está basada en la modificación de la técnica de Bielschowsky para cortes por parafina. Este método da excelentes resultados con cortes por parafina de material fijado en formol y es suficientemente confiable para ser utilizado como rutina.

Reactivos especiales requeridos

Preparar Nitrato de Plata al 20%: para 80 ml de solución se usan 16 g de Nitrato de Plata y 80 ml de agua destilada. De aquí se toman 50 ml para el Nitrato de Plata al 20% y 30 ml para la solución de Plata Amoniacal.
Solución de Plata amoniacal: A 30 ml de Nitrato de Plata al 20%, añadir 20 ml de alcohol absoluto y mezclar. Añadir Hidróxido de Amonio (amoniaco) sin diluir, gota a gota, hasta disolver el precipitado que se ha formado.
Después que se disuelve el precipitado, añadir 5 gotas de amoniaco fuerte.

Procesamiento de las láminas

· Desparafinar hasta alcohol absoluto
· Celoidina al 1%, 1 minuto
· Alcohol al 70%, 5 minutos
· Agua destilada, varios cambios
· Nitrato de Plata al 20% en la estufa, 25 minutos
· Enjuagar en agua destilada, varios cambios
· Formol al 10% preparado con agua corriente, 10 seg cada uno
· Impregnar en plata amoniacal, 30 segundos
· Escurrir la solución de Plata y pasar las láminas por 2 pases de formol al 10% en agua corriente, 1 minuto cada uno
· Agua destilada, enjuagar
· Cloruro de Oro amarillo al 0,2%, 5 minutos
· Agua destilada, lavar
· Hiposulfito de Sodio al 5%, 5 minutos
· Agua corriente, varios minutos
· Alcohol, xilol y poner cubreobjeto con Bálsamo de Canadá

Resultados Figura_2
Neuronas, células nerviosas, axones y dendritas ......... negro
Fondo...................................................................rosado

En esta técnica, que usa fundamentalmente cortes longitudinales de los nervios, se demuestra tanto la integridad como la pérdida de los axones. También se demuestra la destrucción segmentaria, el engrosamiento y la fragmentación de las vainas de mielina en el curso de Neuropatías Periféricas de diversas etiologías.


3. Tricrómica de Masson modificada por Galarraga

Objetivo de esta técnica: Identificar el tejido conjuntivo (4)
Fijación: Bouin, Formol 10% y Susa
Inclusión: Parafina
Corte: 6 a 8 µ

Soluciones

HEMATOXILINA FERRICA DE Weigert
Solución A
Hematoxilina ............................. 1 g
Alcohol absoluto ........................ 100 ml
Solución B
Cloruro férrico al 29% ................ 4 ml
Agua destilada .......................... 95 ml
Ácido clorhídrico concentrado ..... 1 ml



Solución de trabajo
Mezclar la solución A y B a partes iguales

COLORANTE PONCEAU-XILIDINA (SOLUCION STOCK)
Ponceau de xilidina .......... 2 g
Fuschina ácida ................ 1 g
Orange G ....................... 1 g
Ácido acético glacial ......... 0,6 ml
Agua destilada ................ 300 ml
Filtrar
Al colorear diluya 5 ml en 45 ml de agua destilada

LIGHT GREEN AL 1%
Light green …………………… 1 g
Agua destilada ……………… 100 ml

ACIDO FOSFOTUNGSTICO AL 3%
Ácido fosfotúngstico ................... 3 g
Agua destilada ........................... 100 ml

Procesamiento de las láminas

· Desparafinar, alcohol y agua
· Teñir con la Hematoxilina Férrica de Weigert, 2 a 4 minutos
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Solución Ponceau-Xilidina, 10 minutos
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Diferenciar con ácido fostotúngstico al 3%, 1 minuto
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Colorante de Light Green al 1%, 2 a 3 minutos
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Alcohol, xilol y poner cubreobjeto con Bálsamo de Canadá

Las modificaciones introducidas por Galarraga son:
- Se agregan dos colorantes: Orange G y Fuschina ácida
- Se omite el alcohol ácido
- Se diferencia con ácido fosfotúngstico en lugar de fosfomolíbdico
- Se incorporan pases de agua acetizada al 2% entre los colorantes


Resultados Figura_3
Tejido conjuntivo .................... verde
Fibras musculares .................. rojo
Núcleos ................................ azul oscuro o negro

Imagen de Biopsias de nervio periférico. Experiencia en el Instituto de Neurología y Neurocirugía de La Habana

Técnica de Weigert-Pal x 40
Corte transversal
Imagen de Biopsias de nervio periférico. Experiencia en el Instituto de Neurología y Neurocirugía de La Habana
Técnica de Glees - Marsland x 40
Corte longitudinal
Imagen de Biopsias de nervio periférico. Experiencia en el Instituto de Neurología y Neurocirugía de La Habana
Técnica Tricrómica de Masson modificada x 20
Corte transversal
 Discusión
Resumen del procedimiento de trabajo cuando se recibe una biopsia de nervio periférico:

La muestra de nervio debe tener aproximadamente 10-12 mm de longitud.
Se corta el nervio en tres fragmentos iguales, para fijar en Formol 10% Susa, y Flemming respectivamente.
El fragmento fijado en formol por 24 horas pasa directamente al procesador de tejidos, y los cortes se pueden colorear por las siguientes técnicas: Hematoxilina-Eosina, Glees Marsland, Luxol Fast Blue y Fiti Faraco, según el caso lo requiera.
El fragmento fijado en Susa se fija también 24 horas y se pasa directamente al procesador de tejidos. Después se colorea con Hematoxilina-Eosina y con la Tricromica de Masson modificada.
El fragmento del fijador de Flemming se fija por 24 horas y se pone bajo agua corriente por otras 24 horas. De ahí se pasa al procesador de tejidos. Después se colorea por el método de Weigert Pal.
Todas las muestras se incluyen en parafina.
Las muestras fijadas en Flemming se cortan a 12 micras; las fijadas en Susa y formol se cortan a 8 micras.
Estas láminas pueden archivarse por tiempo indefinido porque no presentan disminución de la tinción.

Conclusiones:

En la mayoría de los laboratorios desarrollados los nervios se procesan como para microscopía electrónica, realizándose cortes semifinos que se observan al microscopio óptico. Este tipo de procesamiento, conocido como Microscopía Óptica de Alta Resolución (MOAR), permite obtener unas preparaciones ideales para la observación cualitativa.
En nuestro laboratorio, como no hay recursos para MOAR, se lleva a cabo un procesamiento histológico más corriente, con inclusión en parafina. El diagnóstico anatomopatológico se basa en la descripción cualitativa de los cortes teñidos con las tres coloraciones que se describen en este trabajo.
 Bibliografia
1. C.FA. Culling. Handbook of Histopathological Techniques, Second Edition, London Butterworths 1963. Chapter 19: Tissues requiring special treatment or techniques: The nervous system. Weigert-Pal technique (Kultschitzky’s modification), p. 363
2. Morfometría computarizada en biopsias de nervio sural. Autores: Coro Antich RM, Monzón Herrera L, Galarraga Inza J, Gómez Suárez H, y Gil Gil MX. Enviado a la Revista Patología (México).
3. C.FA. Culling. Handbook of Histopathological Techniques, Second Edition, London Butterworths 1963. Chapter 19: Tissues requiring special treatment or techniques: The nervous system. Glees - Marsland’s technique, p. 359
4. C.FA. Culling. Handbook of Histopathological Techniques, Second Edition, London Butterworths 1963. Chapter 19: Tissues requiring special treatment or techniques: The nervous system. Masson’s Trichromic technique, p. 338
 Comentarios

El 4/3/2004 12:15, lucía gonzález núñez dijo:

De los trabajos de esta sección que he visto, éste es uno de los pocos que se ajustan al perfil de la sección, creo que realizan un trabajo loable a pesar de los pocos recursos que tienen... Felicidades¡¡¡¡

El 10/3/2004 20:41, Eduardo Boix Valdés dijo:

Xiomi, el trabajo es excelente, sé que tu trabajas muy bien los nervios sin la utilización de la M/E, dime si las técnicas se realizan tal como tu la pones en el trabajo.

El 15/3/2004 20:20, María Xiomara Gil Gil dijo:

Sí, hacemos un gran esfuerzo para realizar este trabajo con resursos mínimos pero lo logramos y es lo importante, todo lo que realizamos en él, las técnicas, las soluciones y el proceder está completo y bien detallado. Espero que les sea de utilidad. Gracias.

El 27/3/2004 21:45, Lisette Monzon dijo:

Sin dudas es un trabajo de mucha importancia para los especialistas de anatomia patologica, sobretodo porque los nervios son muestras muy sensibles a los procesamientos y el daño en ellos es muy frecuente.

Felicidades por el trabajo realizado

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