DESCRIPCIÓN DE LAS TÉCNICAS QUE SE USAN EN NUESTRO LABORATORIO 1.Técnica de Weigert-Pal Objetivo de esta técnica: Destacar los anillos de mielina (
1)
Fijación: Líquido de Flemming 24 horas y lavado en agua corriente 24 horas más, antes de pasar al procesador de tejidos
Inclusión: Parafina
Corte: 10 y 12 µ
La mielina es una sustancia lipo-proteica compuesta por esfingomielina, celebrósidos, gangliósidos, colesterol, etc. Tanto en el sistema nervioso central como en el periférico, muchos axones están recubiertos por una vaina de mielina. La presencia de esta sustancia determina la fisiología de estos nervios.
La importancia del estudio de la mielina en Neuropatología radica en que muchas enfermedades neurológicas cursan con afectaciones de la mielina.
Esta técnica se usa fundamentalmente para cortes transversales de nervio periférico porque permite valorar la densidad de fibras mielínicas en los fascículos tanto visualmente, como por morfometría. Además, en este laboratorio se ha estandarizado un procedimiento de morfometría que permite obtener la curva de distribución de los diámetros de las fibras mielínicas, con lo cual se pueden establecer correlaciones morfo-fisiológicas (2)
Soluciones: HEMATOXILINA WEIGERT-PAL Hematoxilina al 10% (alcohólica)............... 5 ml
Agua destilada ....................................... 50 ml
Carbonato de Litio (saturado)................... 1,5 ml
CELOIDINA Celoidina .............................................. 1 ml
Alcohol-éter a partes iguales................... 50 ml
FIJADOR DE FLEMMING Solución de ácido crómico al 1%................ 15 ml
Solución de Tetróxido de Osmio al 2%........ 4 ml (guardada a 4ºC)
Ácido acético glacial................................ 1 ml
DIFERENCIADOR DE PAL Ácido oxálico al 1% a partes iguales con
Sulfato de Potasio al 1%
PERMANGANATO DE POTASIO AL 0,25% Permanganato de Potasio.......................... 0,25 g
Agua destilada .................................. 100 ml
Procesamiento de las láminas · Desparafinar hasta alcohol absoluto
· Sumergir en frasco con celoidina, 1 minuto
· Secar, 1 minuto
· Alcohol al 80%, 5 minutos
· Agua destilada, lavar
· Hematoxilina de Weigert-Pal, 24 horas
· Agua corriente, lavar varios minutos
· Agua destilada, lavar
· Oxidar con Permanganato de Potasio al 0,25%, 5 minutos
· Agua corriente, lavar varios minutos
· Diferenciador de Pal, 1 minuto. Es importante revisar al microscopio pues si está sobreteñido se le da otro pase por el Permanganato de Potasio. En este paso también se revisan los anillos de mielina.
· Deshidratar. Se deja en el primer alcohol después de la Eosina donde el tejido toma un color de fondo rosado y resaltan los anillos de mielina
· Aclarar con 3 ó 4 xiloles
· Colocar el cubreobjetos con Bálsamo de Canadá
Resultado Figura_1 Anillos de mielina................... negro
Fondo.................................. rosado
2. Método de Glees - Marsland Objetivo de esta técnica: Destacar los axones (3) Fijación: Formol 10%
Inclusión: Parafina
Corte: 6 a 8 µ
Esta técnica está basada en la modificación de la técnica de Bielschowsky para cortes por parafina. Este método da excelentes resultados con cortes por parafina de material fijado en formol y es suficientemente confiable para ser utilizado como rutina.
Reactivos especiales requeridos Preparar Nitrato de Plata al 20%: para 80 ml de solución se usan 16 g de Nitrato de Plata y 80 ml de agua destilada. De aquí se toman 50 ml para el Nitrato de Plata al 20% y 30 ml para la solución de Plata Amoniacal.
Solución de Plata amoniacal: A 30 ml de Nitrato de Plata al 20%, añadir 20 ml de alcohol absoluto y mezclar. Añadir Hidróxido de Amonio (amoniaco) sin diluir, gota a gota, hasta disolver el precipitado que se ha formado.
Después que se disuelve el precipitado, añadir 5 gotas de amoniaco fuerte.
Procesamiento de las láminas · Desparafinar hasta alcohol absoluto
· Celoidina al 1%, 1 minuto
· Alcohol al 70%, 5 minutos
· Agua destilada, varios cambios
· Nitrato de Plata al 20% en la estufa, 25 minutos
· Enjuagar en agua destilada, varios cambios
· Formol al 10% preparado con agua corriente, 10 seg cada uno
· Impregnar en plata amoniacal, 30 segundos
· Escurrir la solución de Plata y pasar las láminas por 2 pases de formol al 10% en agua corriente, 1 minuto cada uno
· Agua destilada, enjuagar
· Cloruro de Oro amarillo al 0,2%, 5 minutos
· Agua destilada, lavar
· Hiposulfito de Sodio al 5%, 5 minutos
· Agua corriente, varios minutos
· Alcohol, xilol y poner cubreobjeto con Bálsamo de Canadá
Resultados Figura_2 Neuronas, células nerviosas, axones y dendritas ......... negro
Fondo...................................................................rosado
En esta técnica, que usa fundamentalmente cortes longitudinales de los nervios, se demuestra tanto la integridad como la pérdida de los axones. También se demuestra la destrucción segmentaria, el engrosamiento y la fragmentación de las vainas de mielina en el curso de Neuropatías Periféricas de diversas etiologías.
3. Tricrómica de Masson modificada por Galarraga Objetivo de esta técnica: Identificar el tejido conjuntivo (
4)
Fijación: Bouin, Formol 10% y Susa
Inclusión: Parafina
Corte: 6 a 8 µ
Soluciones HEMATOXILINA FERRICA DE Weigert Solución A Hematoxilina ............................. 1 g
Alcohol absoluto ........................ 100 ml
Solución B Cloruro férrico al 29% ................ 4 ml
Agua destilada .......................... 95 ml
Ácido clorhídrico concentrado ..... 1 ml
Solución de trabajo
Mezclar la solución A y B a partes iguales
COLORANTE PONCEAU-XILIDINA (SOLUCION STOCK) Ponceau de xilidina .......... 2 g
Fuschina ácida ................ 1 g
Orange G ....................... 1 g
Ácido acético glacial ......... 0,6 ml
Agua destilada ................ 300 ml
Filtrar
Al colorear diluya 5 ml en 45 ml de agua destilada
LIGHT GREEN AL 1% Light green …………………… 1 g
Agua destilada ……………… 100 ml
ACIDO FOSFOTUNGSTICO AL 3% Ácido fosfotúngstico ................... 3 g
Agua destilada ........................... 100 ml
Procesamiento de las láminas · Desparafinar, alcohol y agua
· Teñir con la Hematoxilina Férrica de Weigert, 2 a 4 minutos
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Solución Ponceau-Xilidina, 10 minutos
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Diferenciar con ácido fostotúngstico al 3%, 1 minuto
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Colorante de Light Green al 1%, 2 a 3 minutos
· Agua acetizada al 2%, 2 pases
· Alcohol, xilol y poner cubreobjeto con Bálsamo de Canadá
Las modificaciones introducidas por Galarraga son: - Se agregan dos colorantes: Orange G y Fuschina ácida
- Se omite el alcohol ácido
- Se diferencia con ácido fosfotúngstico en lugar de fosfomolíbdico
- Se incorporan pases de agua acetizada al 2% entre los colorantes
Resultados Figura_3 Tejido conjuntivo .................... verde
Fibras musculares .................. rojo
Núcleos ................................ azul oscuro o negro