España

INTRODUCCIÓN: La exposición a cadmio ha sido asociada con el cáncer de próstata humano en algunos estudios epidemiológicos, aunque esta relación suscita una fuerte controversia debido, entre otras causas, a la falta de modelos experimentales animales previos. Varios estudios a largo plazo en ratas revelan una asociación entre los tumores de próstata y la exposición a este metal. El efecto carcinógeno del cadmio puede verse modificado en presencia del zinc. Se pretende caracterizar los cambios en la expresión de Bcl-2, de proliferación celular (PCNA) y apoptosis, en las lesiones pretumorales que aparecen en la próstata ventral de ratas tratadas con cadmio (Cl2Cd) y cadmio asociado a zinc (Cl2Zn).

MATERIAL Y MÉTODOS: Se ha trabajado con 60 ratas macho Sprague-Dawley, durante 24 meses, distribuidos en tres grupos: uno tratado con Cl2Cd (60 ppm), otro con Cl2Cd + Cl2Zn (60 y 50 ppm respectivamente), en el agua de bebida, y un grupo control. Se realizó el estudio inmunocitoquímico (PCNA y BCL-2) y la técnica Tunel (apoptosis), para determinar LIPCNA, LIAPOPTOSIS y fracción de volumen de Bcl-2.

RESULTADOS: Se observaron lesiones displásicas multifocales (leves y severas) en las próstatas ventrales de 29 ratas tratadas. Se vió que el LIPCNA aumentó significativamente en las lesiones frente a las glándulas no displásicas de los controles. El LIAPOPTOSIS de las lesiones severas disminuía, mientras la fracción de volumen de Bcl-2 aumentaba en dichas lesiones.

CONCLUSIÓN: Las lesiones preneoplásicas severas generadas, se caracterizan por el incremento de la proliferación celular y por la disminución de la apoptosis vía expresión de Bcl-2.

La neoplasia intraepitelial prostática (PIN) representa, en el hombre, la lesión precancerosa más avanzada. Existen numerosos datos que nos indican que la PIN precede al carcinoma en 10 ó más años y aparece en muchos casos de cáncer de próstata (1-4). Varios estudios concluyen que la PIN de alto grado es la precursora de la mayoría de los casos de carcinoma prostático (5,6).
Existen marcadores moleculares e inmunohistoquímicos útiles para caracterizar la progresión de la PIN humana. Entre estos marcadores se incluyen los cambios que se producen en diferentes genes que codifican la expresión de proteínas reguladoras de la proliferación celular (ej.: p53, Bcl-2, p16, p22 y Cerb-b2) (1-4,7), el incremento de la proliferación celular, la inestabilidad genética y la modificación en la expresión de algunas oncoproteínas antiapoptóticas (Bcl-2, Bcl-x y Bax) (7).
Se han desarrollado varios modelos de carcinogénesis prostática en rata (8-14) detectándose características morfológicas similares entre los cambios displásicos inducidos en próstata de roedores y la PIN humana (15).
Existen datos epidemiológicos, basados en estudios experimentales, que muestran que el cadmio es un carcinógeno prostático (16,17). La toxicidad del cadmio puede deberse a la inducción de cambios en la homeostasis celular de metales esenciales como son el cobre, el zinc y el calcio. El cadmio y el zinc son cationes de tamaño y carga similar, lo cual sugiere la posibilidad de que ambos metales utilicen transportadores comunes para entrar en los tejidos (18). Hay estudios que indican que el cloruro de cadmio administrado por vía oral, puede producir lesiones premalignas y/o invasivas en el epitelio de la próstata ventral de la rata (17).
El presente estudio pretende caracterizar los cambios en la expresión de Bcl-2, de proliferación celular (PCNA) y apoptosis, en las lesiones pretumorales que aparecen en la próstata ventral de ratas tratadas con cadmio (Cl2Cd) y cadmio asociado a zinc (Cl2Zn).

Animales:

Para los estudios inmunohistoquímicos se utilizaron 60 ratas macho Sprague-Dawley. Los animales se distribuyeron en tres grupos (20 ratas/grupo) en función del tratamiento. Al primer grupo se le suministró, en el agua de bebida, una dosis oral de 60 ppm (partes por millón) de cloruro de cadmio (Panreac. Barcelona, España). El segundo grupo, fue expuesto a la misma dosis oral de cloruro de cadmio y 50 ppm de cloruro de zinc (Panreac. Barcelona, España). En ambos casos se comenzó el tratamiento a los 30 días después del nacimiento. El último grupo corresponde a los controles, los cuales recibieron agua carente de cloruro de cadmio y cloruro de zinc.
El sacrificio de los animales se llevó a cabo mediante narcosis profunda con dióxido de carbono. El complejo prostático fue cuidadosamente diseccionado de la cavidad abdominal de cada animal, se separaron los dos lóbulos ventrales (objeto de nuestro estudio) y se cortaron en rodajas de 2 mm de espesor. El plano de sección fue perpendicular al eje sagital de la glándula. Todas las muestras fueron fijadas por inmersión en paraformaldehído al 4% en buffer salino fosfato (PBS) pH: 7.4 durante 24 horas y posteriormente incluidas en parafina.

Procedimiento de muestreo:

Todas las rodajas obtenidas de cada próstata ventral fueron incluidas en parafina en un solo bloque. Después todos los bloques fueron seccionados seriadamente a 5 micras de espesor, para la aplicación de las técnicas inmunohistoquímicas y para la tinción de hematoxilina-eosina.
Para la evaluación de los resultados inmunohistoquímicos, se seleccionaron 5 secciones mediante muestreo sistemático al azar de cada uno de los bloques obtenidos de cada animal (19,20). Los acinos displásicos y los acinos normales de cada caso se estudiaron por separado.

Criterios morfológicos de clasificación de las displasias:

Los criterios morfológicos que se aplicaron para clasificar las displasias en leves o severas fueron:
Displasias leves: pequeñas alteraciones morfológicas en el epitelio de los alvéolos prostáticos, principalmente en los centrales, que se distinguen por mostrar un epitelio con un mayor número de núcleos, los cuales aparecen amontonados, dándole un aspecto de epitelio seudoestratificado, y muestran variaciones en su tamaño y su forma. También se detecta alteración de la polaridad de las células.
Displasias severas:son lesiones que aparecen extensamente implantadas en el epitelio prostático. se caracterizan por un aumento de grosor del epitelio de los acinos centrales, que llega a mostrar una estructura cribiforme y variación en el tamaño y forma de los núcleos. Se puede apreciar el nucleolo de la célula y observar figuras mitóticas. en algunos casos, el citoplasma de las células es globoso, dándole un aspecto de células en anillo de sello.

Método inmunohistoquímico:

Las secciones una vez desparafinadas y rehidratadas fueron tratadas durante 30 minutos con peróxido de hidrógeno al 0.3% en PBS pH 7.4 con el fin de bloquear la peroxidasa endógena.
Los anticuerpos primarios utilizados en el estudio se indican en la tabla I. En el caso del Bcl-2 se realizó un pretratamiento de la muestra, con el fin de mejorar la visualización de la señal de inmunorreactividad. Este pretratamiento consistió en calentar los tejidos a alta presión, inmersos en una solución de tampón citrato 0.01 M y pH 6.0, en olla a presión (21,22). Se dejaron enfriar, se lavaron con PBS y se incubaron con el anticuerpo primario. Todos los antisueros primarios se diluyeron en PBS pH 7.4 que contenía una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 1% más azida sódica al 0.1%. Las secciones con el anticuerpo primario, se incubaron durante toda la noche a 4ºC.
Como anticuerpo secundario se utilizó una inmunoglobulina biotinilada anti-ratón obtenida en cabra (Biomeda), diluida a una concentración de 1/400 en PBS que contenía una solución de BSA al 1% sin azida sódica. El tiempo de incubación de las secciones con los anticuerpos secundarios fue de 30 min a Tª ambiente. Por último, las secciones se trataron con el complejo avidina-biotina-peroxidasa (Biomeda) y se incubaron de nuevo durante 30 min a Tª ambiente. La inmunorreacción se reveló con una solución que contenía 0.1 g de diaminobencidina (DAB) (3,3’,4,4’ – tetraminobiphenyl, Sigma, St Louis, USA), más 40 ml de peróxido de hidrógeno al 30%. Después se procedió al contraste con verde de metilo o carmín acético. Por último, las muestras se deshidrataron en serie creciente de alcoholes, se pasaron por xileno y se montaron con una resina sintética DPX (Depex, Serva, Heidelberg, Germany). La especificidad de todas las reacciones inmunohistoquímicas se comprobó mediante incubación de las secciones con suero no inmune como sustituto del anticuerpo primario.

Tabla 1

ANTÍGENO	TIPO	FUENTE	DILUCIÓN
Antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA)	Monoclonal	Biomeda, Foster city, CA, USA	1:50
Bcl-2	Monoclonal	Dako, Copenhagen, Dinamarca	1:10

Detección de apoptosis:

Para visualizar los núcleos apoptóticos se recurrió a la técnica Tunel (TdT-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling), usando el kit para la detección de muerte celular in situ (Boehringer Mannheim). Las secciones de los tejidos una vez desparafinadas y rehidratadas en serie decreciente de alcoholes se digirieron con proteinasa K (Boehringer Mannheim) a una concentración de 10 ml/ml en TRIS/EDTA pH 8, a 37 ºC, durante 30 minutos. La peroxidasa endógena se inactivó incubando en peróxido de hidrógeno 0.3% en agua destilada durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo, los cortes se incubaron en una mezcla de TdT (Terminal deoxynucleotide Transferase) más solución de nucleótidos marcados (2:1) durante 1 hora a 37 ºC. Posteriormente, se incubaron en anticuerpo antifluoresceína conjugado con peroxidasa a 37 ºC durante 30 minutos. Se reveló con diaminobencidina y se contrastó con carmín acético. Por último, las muestras se deshidrataron en serie creciente de alcoholes, se pasaron por xileno y se montaron con DPX.

Cuantificación de proliferación celular y apoptosis:

Se cuantificaron mediante la evaluación del índice de marcaje de proliferación celular (LIPCNA) (7) y de apoptosis (LIAPOPTOSIS) en cada sección seleccionada de ratas control, de lesiones leves y de lesiones severas, mediante la fórmula: número de núcleos marcados x 100/número total de núcleos (marcados y no marcados). Todas las medidas se realizaron con un microscopio Olimpus provisto de un objetivo de inmersión x 100 (apertura numérica 1.4) y una magnificación final de x 1200. El microscopio estaba conectado a una videocámara, además de tener una platina motorizada, conectada a un ordenador DELL OPTIPLEX GX110. El software utilizado (Stereologic Software Package, GRID; Interactivision, Silkeborg, Denmark) intervenía en el movimiento en dirección XY de la platina y permitía el muestreo sistemático al azar de los campos seleccionados. Se valoraron un promedio de 100 campos/corte y un total de 500 núcleos epiteliales por sección en cada grupo (acinos no displásicos, displasias leves y displasias severas) y por animal. La selección de campos por muestreo sistemático al azar asegura que las estimaciones de proliferación celular y apoptosis son representativas de todo el tejido prostático, ya que no todas las regiones de la próstata tienen el mismo índice de proliferación y de muerte celular (7). Se consideraron PCNA-positivos todos los núcleos que expresaban PCNA, independientemente de la intensidad de la reacción. Respecto a la apoptosis, se consideraron positivos todos los núcleos que mostraban una tinción intensa y uniforme.

Cuantificación de la expresión de Bcl-2:

Para cuantificar la inmunoexpresión de Bcl-2, se midió la fracción de volumen (VF) y se expresó como porcentaje de epitelio inmunoteñido. Se seleccionaron tres zonas de epitelio normal mediante muestreo sistemático al azar, utilizando el programa GRID, así como las zonas displásicas en caso de existir, y se fotografiaron con una magnificación final de x 500. La estimación se realizó con el programa de análisis de imagen Scion Image Beta 4.02 Win, disponible en Internet (http://www.scioncorp.com/frames/fr_scion_products.htm) aplicando un umbral de discriminación a la imagen, con el fin de obtener una imagen binaria en dos tonos. Posteriormente, se realizó la medida de la fracción de área (volumen) ocupada por la zona inmunoteñida en el tejido epitelial prostático. Las mediciones se realizaron tanto en el epitelio normal como en las zonas que presentaban displasia.

Análisis estadístico:

Se calculó la media y error estándar de la media (SEM) de todos los parámetros evaluados. Las diferencias entre los acinos normales, las displasias leves y las displasias severas se evaluaron mediante ANOVA. La significación se estudió mediante la prueba de la mínima diferencia significativa (LSD) y el nivel de significancia utilizado fue de p<0.05. Previamente, todas las variables fueron normalizadas mediante transformación logarítmica.

Histología:

Se observan displasias leves en 20 de los animales estudiados sometidos al tratamiento con metales, así como displasias severas en 11 de ellos. Los acinos de los controles muestran un epitelio simple columnar (fig. 1), así como los acinos no displásicos de los casos tratados con Cl2Cd o Cl2Cd + Cl2Zn. En los animales tratados aparecen displasias leves y displasias severas. En las displasias leves se observa un epitelio engrosado, con un mayor número de núcleos, principalmente, en los acinos centrales (fig. 2). En las displasias severas el epitelio muestra una estructura cribiforme. Los núcleos de estas displasias muestran variaciones en su tamaño y su forma, hay modificaciones más acusadas de la polaridad de las células y, en algunos casos, el citoplasma balonizado adoptando el aspecto de células en anillo de sello. Además, hemos encontrado células en mitosis (fig.3). Cabe destacar que estas displasias aparecen distribuidas multifocalmente.

Inmunotinción para PCNA:

En todos los casos estudiados (control y tratados) se observa inmunorreactividad para PCNA en los núcleos de las células epiteliales de los acinos (fig. 4). A nivel de las displasias, se aprecian núcleos epiteliales inmunopositivos para PCNA (fig. 5) tanto en las displasias leves como en las severas. El LIPCNA muestra un incremento significativamente entre el epitelio no displásico y las displasias. Sin embargo, no existen diferencias significativas entre las displasias leves y severas (fig. 6).

Apoptosis:

En el epitelio de los acinos periféricos y centrales de todos los casos control y tratados (cloruro de cadmio y cloruro de cadmio más cloruro de zinc) estudiados se detectan núcleos apoptóticos, los cuales se caracterizan por presentar una coloración homogénea y aspecto compacto (fig. 7). Asimismo, a nivel de las displasias (leves y severas) también se pueden apreciar núcleos positivos (fig. 8). El LIAPOPTOSIS muestra un disminución significativa en las displasias severas frente a las displasias leves y los acinos no displásicos (fig. 9).

Inmunotinción para Bcl-2:

La expresión de Bcl-2 aparece, principalmente, en los acinos periféricos, dispuesto de forma granular en el borde apical de la célula (fig. 10). En el citoplasma de las células epiteliales que forman parte de las displasias, encontramos expresión de Bcl-2, que se distribuye de forma focal irregular (fig. 11). La VV Bcl-2 presenta variaciones significativas entre las displasias, mientras que éstas no difieren del epitelio no displásico (fig. 12).

El presente estudio confirma que la administración crónica de cloruro de cadmio a dosis bajas y por vía oral, produce tumorogénesis prostática, tal y como ya han comentado otros autores (17). Asimismo, se detectan cambios histológicos, cuya morfología permite clasificarlos como displasias (14,23). Estos cambios se observan en las ratas sometidas al tratamiento con metales (Cl2Cd y Cl2Cd + Cl2Zn). Se ha observado un aumento de la proliferación celular en el inicio de las displasias (displasias leves) que se mantiene conforme evoluciona la lesión (displasias severas), lo cual puede estar relacionado con la agresividad de las lesiones prostáticas (24). De igual manera, se ha detectado una disminución de la apoptosis en las displasias severas, acompañada de un aumento de proliferación celular, tal y como describieron Montironi et al. (1994) (25) y Erbersdobler et al. (2002) (26) en la PIN humana. Este fenómeno puede ser el responsable de la iniciación del cáncer de próstata y de su progresión. La apoptosis está regulada por diferentes factores, entre los que se encuentra la proteína Bcl-2. Se ha manifestado una relación inversa entre la expresión de Bcl-2 y apoptosis en las displasias encontradas en la próstata ventral de la rata, tal y como se ha postulado para la PIN humana (2,27). Cuando la exposición al cadmio es prolongada, en algunas zonas del epitelio se producen modificaciones que pueden dar lugar a una sobreexpresión de Bcl-2 y, por tanto, a un incremento de la resistencia a la apoptosis tal y como describieron Martín et al. (2001) (7).
Existen diferencias entre la próstata de la rata y la humana en cuanto a la expresión y localización de PCNA y Bcl-2. En la próstata humana, el compartimiento de células basales representa la zona con mayor actividad proliferativa, mientras en la próstata de la rata, las células basales son escasas o están ausentes en algunos acinos. Además, en el caso de la rata, la actividad proliferativa se localiza en las células columnares (28).
Se puede concluir que las lesiones preneoplásicas severas generadas, se caracterizan por el incremento de la proliferación celular y por la disminución de la apoptosis vía expresión de Bcl-2.

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