Cuba

La ataxia espinocerebelosa tipo 2 es la forma molecular del grupo de las enfermedades heredodegenerativas más frecuentemente observada en Cuba y en especial en la provincia Holguín donde alcanza una tasa de prevalencia tan alta como 43 por 100000 habitantes con 125 familias afectadas Se caracteriza clinicamente por un síndrome cerebeloso asociado a alteraciones de los reflejos osteotendinosos y a movimientos sacádicos enlentecidos entre otras manifestaciones menos constantes y desde el punto de vista genético y molecular está dada por una mutación en el cromosoma 12q23-24.1 que consiste en la expansión intergeneracional de la secuencia de trinucleótidos CAG repetidos. Los estudios anatomopatológicos alteraciones cerebelosas, disminución en el número neuronal de la oliva inferior, de las fibras olivocerebelares, de las neuronas pontinas, de las neuronas de la sustancia nigra y en algunos casos del locus cerúleo, de los ganglios dorsales, de las motoneuronas del asta anterior y de la columna de Clarke así como diferentes grados de desmielinización .En nuestro estudio de serie de casos exponemos algunos resultados obtenidos mediante técnicas morfo-estereologicas aplicada a una muestra constituida por los cinco fallecidos con ataxia espinocerebelosa tipo 2 necropsiados en el año 2001 en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario "Vladimir I Lenin" de Holguín a través del sistema de análisis de imágenes COMSDI_PLUS obteniendo como resultados la existencia de una reducción numérica global de las células de Purkinje siendo más marcada en aquellos que mostraron las menores edades de inicio , los mayores tiempos de evolución de la enfermedad y las mayores repeticiones de CAG con 47 y 43 respectivamente y que el volumen nuclear y el factor de forma disminuyen en las neuronas cerebelosas, del tálamo y de la corteza cerebral frontal.

La forma molecular del grupo de las ataxias cerebelosas autosómicas dominantes (ADCA) más frecuentemente observada en Cuba y en especial en la provincia Holguín, donde alcanza su más alta tasa de prevalencia es la ataxia espinocerebelosa tipo 2 (1,2). Se caracteriza clínicamente por un síndrome cerebeloso asociado a alteraciones de los reflejos osteotendinosos y a movimientos sacádicos enlentecidos y oculares limitados entre otras manifestaciones menos frecuentes. (1,2,3,4,5).
Es causada por una mutación en el cromosoma 12q24.1 que consiste en la expansión intergeneracional de una secuencia de CAG localizada en el primer exón del gen SCA2. El gen mutado es traducido en una proteína –ataxina2- con un dominio poliglutamínico expandido que le adjudica una ganancia de función que resulta tóxica a poblaciones neuronales específicas, particularmente a las células de Purkinje de la corteza cerebelosa (6,7,8,9,10).
En estudios anatomopatológicos realizados por Estrada et al (11) se describen alteraciones cerebelosas que incluyen la disminución del peso global del cerebelo, la pérdida marcada de las células de Purkinje y/o su disminución, la reducción del árbol dendrítico sobre todo del paleo y neo cerebelo , degeneración axonal y pobre densidad en las fibras de los pedúnculos cerebelosos medios e inferiores así como disminución en el número neuronal de la oliva inferior, de las fibras olivocerebelares, de las neuronas pontinas, de las neuronas de la sustancia nigra y, en algunos casos, del locus coeruleo, de los ganglios dorsales, de las motoneuronas del asta anterior y de la columna de Clarke así como diferentes grados de desmielinización .
Objetivos:
General: Contribuir al conocimiento de las alteraciones neuropatológicas que se presentan en la ataxia espinocerebelosa tipo 2.
Específicos:
1- Realizar el conteo de células de Purkinje en la corteza cerebelosa en los dos grupos estudiados.
1-Determinar el comportamiento del volumen nuclear en la corteza motora, el núcleo ventro-lateral del tálamo y en el vermis cerebeloso en individuos normales y enfermos de SCA2.
2-Comparar el resultado de este indicador en las tres áreas estudiadas

Se realizó un estudio de serie de casos aplicando morfometría microscópica a la muestra constituida por los cinco fallecidos con ataxia espinocerebelosa tipo 2 necropsiados en el año 2001 en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Universitario "Vladimir I Lenin" de Holguín .
En tres de los casos se conocía el numero de repeticiones de CAG del gen SCA2.Como control de los parámetros morfoestereológicos se seleccionaron aleatoriamente en un grupo de 20 fallecidos cuya edad promedio fue de 51 anos, que no portaran la enfermedad y que no presentaran otras patologías del SNC ni trastornos tóxicos o metabólicos que pudieran afectarlo secundariamente , en los cuales se realizarom un total de 16000 mensuraciones.
Las preparaciones histológicas fueron procesadas con la técnica de inclusión en parafina , cortadas de forma seriada a 3-5-micras y coloreadas con las tinciones de Hematoxilina y Eosina , Luxol Fast Blue con Cresyl Violeta y la doble impregnación argéntica de Glees- Masland. Las muestras para las mismas fueron tomadas del culmen cerebeloso , del núcleo ventro lateral del tálamo y de la corteza motora frontal (circunvolución pre-central).Las mediciones se realizaron sobre imágenes digitalizadas a través del sistema de análisis de imágenes COMSDI_PLUS (Computer Assisted Morpho-Stereological y System Using DigitalImage) (23) de la Facultad de Ciencias Médicas de Holguin , determinándose los siguientes indicadores :
-Volumen Nuclear (Vn) : Con un aumento de 100 x se midieron todos los diámetros mayores y menores de los núcleos neuronales en la pantalla del monitor procediendose al cálculo del indicsdor utilizando la fórmula de Palkovits II para el volumen nuclear absoluto:
V= 1.04 (ab) Ö (ab)
donde a es el diámetro mayor y b es el diámetro menor (diámetros en micrómetros)
-Conteo de células: Se realizo contando todas las células de Purkinje que estuvieran presentes en la pantalla con aumento de 10 x.
El volumen nuclear se determinó en las neuronas de las tres áreas seleccionadas , en el caso de la corteza motora frontal los valores que se discuten corresponden al valor promedio de las células de todas sus capas y en el caso del neocerebelo se analizaron separadamente los valores de las capas molecular y granulosa debido a las diferencias histológicas entre ellas.
El procesamiento estadístico de los datos primarios se realizó mediante el paquete estadístico SYSTAT versión 3.0 9 (249) determinándose el por ciento, el valor promedio , la desviación estándar y el coeficiente de variación para el análisis descriptivo mientras que para el comparativo se aplicó el análisis de varianza (ANOVA) buscando diferencias entre grupos con un nivel de significación de p = 0 .05.

En todos los casos existió una reducción del peso de los hemisferios cerebrales y del cerebelo siendo mas marcada en los casos 1y2, El estudio histológico del cerebelo mostró una reducción numérica global de las células de Purkinje en el grupo de los casos siendo más marcado en los casos 1 y 2 . El volumen nuclear neuronal sufrió una reducción en las tres áreas estudiadas .

Los cinco pacientes tenían diagnostico clínico de Ataxia espinocerebelosa tipo 2 y procedían de familias estudiadas de varios años de evolución , la edad de inicio fue en etapa de adolescencia y adultez joven en cuatro de los casos, siendo la edad mas temprana la del caso 1 con 14 años . Fue sólo en el caso 4 donde el inicio de la enfermedad alcanza la edad geriátrica (65 anos) .Los casos 1, 2 y 4 tenían estudios moleculares realizados con mas de 35 repeticiones de CAG(cuadro1).
En todos los casos existió una reducción del peso de los hemisferios cerebrales y del cerebelo siendo mas marcada en los casos 1y2, El estudio histológico del cerebelo mostró una reducción numérica global de las células de Purkinje en el grupo de los casos siendo más marcado en los casos 1 y 2 .

La disminución en el número de las células de Purkinje en todos los casos fue mayor del 90% con los valores mas bajos en los casos 1y2 demostrando no sólo el efecto neurotóxico de la ataxina 2 sobre las células de Purkinje sino que las alteraciones neuropatológicas mas graves en dichas células guardan relación proporcional directa con el tiempo de evolución, con las mayores repeticiones de CAG y con las edades de inicio mas tempranas corroborando así los resultados obtenidos en estudios anatomopatológicos , histoquímicos y moleculares( 8,9,10,11,12,13,28).
El comportamiento del volumen nuclear fue similar en las tres áreas estudiadas con una reducción del mismo siendo esta mayor en las estructuras cerebelosas, lo cual pone de manifiesto que en las células de las tres estructuras estudiadas se están llevando a cabo procesos relacionados con daño morfológico y estructural, esto pudiera estar en relación con un efecto neurotóxico "per se " de la ataxina 2, mas amplio que el que se le ha asignado hasta el momento (11,12,13) o a que este daño morfológico depende de la alteración que se produce por la repercusión en el nivel funcional cerebro - cerebelo explicando en parte la disfunción fronto - ejecutiva que se observa en muchos de nuestros pacientes afectados por la SCA2, siendo este indicador morfométrico útil en la evaluación anatomopatológica de la lesión estructural como quedó demostrado en el análisis de varianza (ANOVA) donde mostró valores significativos.


Conclusiones:
- Los pacientes con edades de inicio más tempranas mostraron repeticiones más largas de CAG.
- Las células de Purkinje mostraron una reducción marcada en todos los casos enfermos en relación con el grupo control.
- El volumen nuclear disminuyó en las tres áreas estudiadas en el grupo de los enfermos, no así en el grupo control, demostrando que en dichas localizaciones están ocurriendo procesos patológicos y que este indicador es útil para su valoración.

1. Paneque H M, Santos F N,Tamayo CH V, Reynaldo R A, Velazquez P L, Almaguer M L, et al. Ataxia espinocerebelosa tipo2:aceptación del diagnóstico pre-natal en descendientes en riesgo.Rev Neurol 2001; 33 (10) : 904-908.
2. Velazquez PL, Almaguer ML, Santos FN, Hechavarria PR, Sanchez CG, Paneque HM . Ataxia espinocerebelosa tipo2 en Cuba.Estudio del fenotipo electrofisiológico y su correlación con variables clínicas y moleculares. Rev Neurol 2001; 33(12):129-136.
2. Velazquez PL, Santos FN, Garcia R, Paneque HM, Medina HE, Hechavarria PR. Las ataxias hereditarias en Cuba. Aspectos históricos, epidemiológicos, clínicos electrofisiológicos y de neurología cuantitativa. Rev Neurol 2001; 32:606-611.
3. Velazquez PL, Santos FN, Garcia R, Paneque HM, Medina HE, Hechavarria PR. Epidemiología de la ataxia hereditaria cubana.Rev Neurol 2001; 32:606-611.
4. Orozco DG, Nodarse FA, Cordoves R, Aurburger G. Autosomal dominant cerebellar ataxia: clinical analysis of 263 patient from homogeneus population in Holguin, Cuba.Neurology 1990; 40:1369-75.
5. Pulst SM, Nechiporuk A, Nechiporuk T, Gispert S, Chen XN, Lopes-Condes I, et al. Moderate expansion of a normally biallelic trinucleotide repeat in spinocerebellar ataxia type2 gene using a direct identification of repeat expansion and clonning technique, DIRECT.Nat Genet 1996 ;14:277-84.
6. Pulst SM, Nechiporuk A, Starkmann S. Anticipation in spinocerebellar ataxia type2.Nat Genet 1993; 5:8-10.
7. Santos FN, Aguiar J, Fernandez J, Vazquez M, Aurburger J,etal. Diagnostico molecular de una muestra de la poblacion cubana con ataxia espinocerbelosa tipo2.Biotec Apl 1999; 16 : 219 -22.
8. Saudou F, Finkbeir S, Devys D, Greenbreg ME. Phenotype variation correlates with CAG-repeat lengh in SCA2: a study of 28 Japanese patients. J Neurol Sci 1998;159:202-8.
9. La Spada AR, Paulson HL, Fischbeck KH . Trinucleotide repeat expansion in neurological disease. Ann Neurol 1994; 36: 814-22.
10. Huynh DP, Figueroa K, Hoang N, Pulst SM. Nuclear localization or inclusion body formation of ataxin-2 are not neccesary for SCA2 pathogenesis in mouse or human.Nature Genet 2000 26:44-50.
11. Huynh DP, DelBigio MR, Ho DH, Pulst SM. Expression of ataxin-2 in brains from normal individuals and patients withAlzheimer's disease and spinocerebellar ataxia 2.Ann.Neurol.45:232-241.

12. Cancel G, Durr A, Didierjean O, Imbert G, Burk K, Lezin A et al . Molecular clinical correlations in spinocerebellar ataxia 2 : astudy of 32 families. Hum.Molec.Genet. 6: 709-715 ,1997 .
13. Estrada R, Valles L, Galarraga J. Heredoataxias. Estudio neuropatológico en 3 casos.Rev.Cub.Med 1980; 19:225-37.
14. Sorensen FB..Stereological stimation of the mean and variance of nuclear volume from vertical seccion.JMicroscopy.1991;162(2):203-29.
15. Yokota O, Ishizu H, Terada S, Tsuchiya K, Haraguchi T, Nose S, et al. Preservation of nigral neurons in Pick's disease with Pick bodies: a clinicopathological and morphometric study of five autopsy cases.J Neurol Sci 2002 Feb 15;194(1):41-8 Lin KP.
16. Holton JL, ReveszT, Crooks R, Scaravilli F.Evidence for pathological involvement of the spinal cord in motor neiron disease-inclusion dementia. Acta Neuropathol (Berl) 2002 Mar;103(3):221-7.
17. Cruz Oribe LM. Howard CV. Estimating the lenght of a bounded curve in three dimensions using total vertilcal proyections. J.Mic.1990;160(1):89-95.
18. Gundersen HJ. Some new, simple and efficient stereological methods and their use in pathological research and diagnosis. Acta Pathol Microbiol Inmunol Scand.1988;96:379-394.
19. Brandt Sorensen F. Biology of disease cuantitative analysis of nuclear size for objetive malignancy grading: A review with emphasis on new unbiased stereological methods. Lab Inv.1992,66(1):4-23.
20. Zhonghua Yi , Xue Za Zhi (Taipei) An electrophysiologic and pathologic study of peripheral nerves in individuals with Machado-Joseph disease. 1998;Apr;61(4): 181-7.
21. Cruz Oribe LM. On the empirical variance of a fractionator estimate.J Mic.1990;160(1):89-95.
22. Cruz Oribe LM, Wetbel ER. Recent stereological methods for cells biology: A brief survey. Am J Phiysiol.1990;258:148-156.
23. Toga AW, Thompson PM. New approaches in brain morphometry. Am J Geriatr Psychiatry 2002 Jan-Feb;10(1):13-23.
24. Schulz U, Hunziker H, Frey H, Shweizer A .Postmortem changes in stereological parameters of cerebral neurons. Path.Res.Pract.166,260-270,1980.

25. Diaz Rojas PA. Sistema morfo-estereológico asistido por la computadora con digitalizacion de imágenes (COMSDI-PLUS).Trabajo presentado en Congreso Internacional de Informática Médica 94\1994.Nov 23-25; La Habana: Sociedad Internacional de Informática Médica, 1994.
26. Ato M Lopez JJ. Fundamentos de Estadística con SYSTAT.1ra .ed.Madrid:RAMA,1994.
27. Estrada R, Galárraga J, Orozco G, Nodarse A, Auburger G . Spinocerebellar ataxia 2 (SCA2): morphometric analyses in 11 autopsies. Acta Neuropathol (1999) 97: 306-310.