VI Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

El siguiente algoritmo es una representación del esquema seguido en nuestro laboratorio al analizar una citología. (Algoritmo)

La inmunohistoquímica (ICQ) puede utilizarse sobre los siguientes tipos de especimenes:
Citología exfoliativa.
• Líquidos.
• Improntas.
• Biopsia pos aspiración con aguja fina (BAAF).
• Monocapa.
• Bloque celular
El método puede ser utilizando en frotis secos al aire, fijados en alcohol o procesados en citocentrifuga.

Técnica:
Los siguientes elementos son de suma importancia en el proceso de la técnica de Inmunohistoquímica (3).
• Fijación.
• Permeabilización.
• Recuperación antigénica.
• Almacenamiento.
• Tipos de anticuerpos.
• Método de detección del anticuerpo primario (estrepto-avidna-biotina, peroxidasa-antiperoxidasa etc. )

El éxito de la ICQ depende de :
• Interpretar adecuadamente los hallazgos citológicos en relación con la información clínica y formularse una pregunta que pueda ser respondida apropiadamente por la ICQ, (Ej. Linfoma contra carcinoma).
• Utilizar anticuerpos bien caracterizados cuya especificidad halla sido claramente definida bioquímicamente.
• Evaluación de los resultados por un citopatólogo con experiencia en la morfología con microscopía de luz y con la información clínica.
Si los resultados de la ICQ no son concluyentes el diagnóstico debe ser hecho, con base en la impresión citológica con microscopía de luz.

La elección de los anticuerpos para resolver un problema particular debe ser hecha con la siguiente base.
• Elegir un panel de anticuerpos es mejor que elegir uno solo.
• Si es posible debe elegirse anticuerpos que expresen la mayoría de las células y no solo en algunas (Ej. desmina contra mioglobina en un rabdomiosarcoma)
• Para antígenos que ocurren como familias multigénicas es preferible usar anticuerpos monoclonales.

Por lo tanto el abordaje con ICQ debe ser individualizado para cada caso problema, ha sido de gran ayuda la construcción de algoritmos que permiten utilizar razonablemente los anticuerpos paso por paso, para iniciar con anticuerpos muy generales como el ACL o el AME hasta cada vez mas específicos de acuerdo al tumor que se sospecha Fig_1

Los problemas técnicos ocurren por múltiples razones, las más comunes son 4:
• Extendidos de mala calidad y mal fijados.
• Extendidos con mezcla de células malignas de diferentes partes del tumor y con células benignas.
• Diluciones inapropiadas.
• Condiciones del laboratorio inadecuadas que alteran la especificidad del anticuerpo.
• Expresión de marcadores ectópicos por una minoría de las células.
• Tumores que exigen diferentes vías de diferenciación y por lo tanto nunca podrán ser clasificados por ICQ.
• Especimenes en escasa cantidad.

Es crucial que el citopatólogo debe estar satisfecho con el número de células en las que va a basar su diagnóstico y no forzar un diagnóstico solo con algunas células.
Pueden utilizarse en caso necesario las laminillas ya teñidas en pap o diff-quik
Y puede hacerse con o sin previa decoloración, ya que los resultados son similares.
Sherman y asociados 5 describieron la técnica de transferencia para especimenes con muy pocas células, con esta técnica las células son levantadas de la laminilla redisolviendo en un nuevo medio de montaje que permite ser removido de la laminilla y luego seccionarse en piezas y recolocarse en laminilla para utilizar varios anticuerpos. (6) Fig_2 , Fig_3

Interpretación y limitaciones de la Inmuncitoquímica:
Al igual que en patología quirúrgica la selección del panel de anticuerpos (Ac), depende de una adecuada interpretación morfológica. Los Ac disponibles para citología pueden ser policlonales o monoclonales , así mismo su sensibilidad y especificidad es variable, por otra parte la diferenciación de muchos tumores ofrece un amplio espectro, por eso mismo es indispensable el uso de controles positivos y negativos. El patrón de inmunotinción dependerá de la presencia de células neoplásicas, de la tinción de fondo y de la concentración del anticuerpo así como de la localización de la tinción (membrana, núcleo ,citoplasma). Es importante tomar en cuenta que la heterogenicidad de la tinción es mas la regla que la excepción.

Los Falsos Positivos pueden se resultado de múltiples factores:
• Lo primero y mas importante es que el citopatólogo no pueda distinguir entre células normales o reactivas de células neoplásicas sobre todo en extendidos con escaso material.
• Secado en cualquier paso de la reacción puede producir que el Ac se una en forma inespecífica, lo mismo sucede con la necrosis, células poco conservadas o estiradas.
• Debe tenerse mucha precaución con el fondo teñido sobre todo cuando se utilizan policolonales, puede haber una reacción cruzada, el Ac puede no ser tan específico como lo dice el fabricante, fijación inapropiada, bloqueo incompleto de la peroxidasa endógena o de la actividad de la biotina.
• Solo la experiencia y confianza en el Ac que se usa puede satisfacer al observador.

Los Falsos Negativos son también multifactoriales, las causas mas frecuentes son:
• Fijación inapropiada que resulta en desnaturalización o enmascaramiento de los Antígenos.
• Concentraciones o muy altas o muy bajas.
• Recuperación insuficiente de Antígenos.
• Decoloración del pap.

Si bien la cantidad de anticuerpos actualmente en uso es impresionante haremos un breve resumen de los más accesibles a un laboratorio de nuestro medio en relación con las neoplasias mas frecuentes.

Carcinomas:
El diagnóstico de este tipo de tumores en citología depende del sitio de origen, el grado de diferenciación y el aspecto morfológico.
Los tumores bien diferenciados ofrecen poca dificultad sobre todo con experiencia, por otra parte los tumores anaplásicos de células pequeñas son difíciles de diferenciar de un linfoma o en ocasiones de un sarcoma de células pequeñas. Así mismo un carcinoma anaplásico de células grandes es difícil de diferenciar de un linfoma de células grandes, un melanoma o sarcoma. Y es en este tipo de circunstancias donde adquiere valor el uso de la IHQ. En general los siguientes marcadores son utilizados en el diagnóstico diferencial racional de este tipo de tumores:
• CK positiva en todos.
• Algunos tipos pueden coexpresar vimentina o neurofilamentos.
• AME positivo en todos.
• ACL negativos en todos.

La mayor parte de los adenocarcinomas son positivos para CK 7, 8,18 y 19 los carcinomas escamosos son positivos para queratinas mas complejas como: 4,5,14,15 y 16.3,4
Carcinomas neuroendocrinos:
Un panel razonable para casi todos los tipos de carcinomas neuroendocrinos desde los bien diferenciados hasta el de células pequeñas es:
Sinaptofisina, cromogranina y queratinas (7) Fig_4

Carcinoma de células pequeñas de pulmón:
Los diagnósticos diferenciales incluye el carcinoide bronquial, los carcinoma escamosos y adenocarcinomas poco diferenciados, carcinomas metastáticos como el linfoepitelioma, el linfoma, sarcoma de Ewing extraóseo, melanoma, y ocasionalmente seminoma.
Los siguientes hallazgos por inmunohistoquímica pueden hacer el diagnóstico.(4) Fig_5
• CK, positivo la mayoría.
• Neurofilamentos, ocasionalmente.
• ENE positivos la mayoría.
• Sinaptofisina y cromgranina pueden ser positivos.
• AME positivos.
• ACE positivos.
• ACL negativo.

Carcinoma de Tiroides: Fig_6
La expresión de los marcadores de los diferentes tumores tiroideos y así como su sensibilidad y especificidad se ilustran en la Tabla_1 (8),(9) un ejemplo de la utilidad de la ICQ es el carcinoma medular de tiroides en el que el diagnóstico diferencial incluye: carcinoma papilar, folicular y anaplásico de tiroides, carcinomas poco diferenciados, linfomas, plasmocitomas y carcinoides.
Los hallazgos de inmunohistoquímica de ayuda son:
• Coexpresión de CK, vimentina y neurofilamentos.
• Calcitonina positiva.
• ENE positiva.

Carcinoma Hepatocelular: Fig_7
Básicamente el diagnóstico diferencial radica con un adenocarcinoma metastático o con un colangiocarcinoma.(10), (11) En la Tabla_2 se desglosa la positividad de los marcadores más útiles en la diferenciación de estas neoplasias.
• AFP positiva
• ACE positiva
• Vimentina negativa.
• CK 19 negativa
• CK 8 y 18 positiva.

Adenocarcinoma prostático: Fig_8
Lo mas importante es descartar un carcinoma trancisional de vejiga. Además, los marcadores son de gran utilidad para determinación de sitio primario en las metástasis.
La inmunoreactividad es:
• APE positivo
• FPE positiva

Linfomas: Fig_9
La BAAF es usualmente el primer método empleado en el diagnóstico de un ganglio linfático crecido, los principales diagnósticos diferenciales son: Linfomas de bajo grado contra hiperplasia, y la distinción de los linfomas de alto grado con carcinomas anaplásicos y sarcomas (12) , (13)
Tres marcadores son particularmente de ayuda: ACL, vimentina y CK. Estos marcadores son sensibles, específicos y complementarios. Independientemente del tipo, los linfomas son positivos para vimentina y negativos para CK en más del 80% de los casos. En términos generales, entre el 86 y el 100% de los linfomas son positivos para ACL, y el linfoma T es el más frecuentemente negativo para ACL En general, si el ACL y la vimentina son positivos y la CK negativa podemos asumir que se trata de un linfoma no Hodgkin (14)
En el caso de que algunos de estos marcadores sean ambiguos o negativos se puede recurrir a rearreglo génico específico.
La ICQ puede analizar tanto la clonalidad como el subtipo de linfoma utilizando marcadores para linfocitos B, T y monolitos; con este abordaje se confirma el diagnóstico original hasta en el 46% de los casos y lo modifica en el 24%.En muchos casos el análisis con ICQ es comparable en sus resultados con el del genotipo (14) , (15)
El antígeno de membrana epitelial (AME) es positivo en los linfomas anaplásicos Ki-1 (CD30) y en el 12% de otros LNH; también es positivo en las células de Reed-Sternberg y en los plasmocitomas.
Las células dendríticas de los centros germinales de los ganglios linfáticos reactivos y de los LNH son positivas para CK, esto contrasta con el resto de las células.

En resumen la expresión de los LNH puede ser:
• ACL positivo.
• Vimentina positivo.
• CK negativo.
• AME solo algunos tipos.

El panel sugerido para el estudio de los linfomas es: ACL, vimentina, CK, cadenas kappa/lambda, y marcadores de superficie B y T.
Tabla_3, inmunofenotipo de los linfomas.

Melanoma: Fig_10
Tanto las células tumorales amelanóticas como las que contienen melanina son positivas para vimentina; más del 90% de los melanomas son fuertemente positivos para vimentina. Casi todos son positivos para proteína S-100, este marcador es el más sensible pero no es específico. La positividad paral HMB-45 es citoplásmica y finamente granular, este marcador es altamente específico pero menos sensible (son positivos entre el 70 y 92%).(4) , (16) Puede dar falsos positivos en algunos líquidos de ascitis, también son positivos el angiomiolipoma y la linfangiomiomatosis pulmonar, por lo que el diagnóstico no debe basarse en un solo anticuerpo, sino en un panel:
• Vimentina positiva.
• Proteína S-100 positiva.
• HMB-45 positivo.
• CK y ACL usualmente negativos.

Sarcomas: Fig.11
La vimentina es positiva en prácticamente todos los sarcomas no musculares, teniendo en cuenta que algunos carcinomas como los renales y endometriales también expresan vimentina, y que ciertos sarcomas como el sinovial y el epiteliode, coexpresan vimentina y CK.
Los marcadores musculares como desmina, AML y mioglobina son útiles en el diagnóstico de rabdomiosarcomas y leiomiosarcomas; el factor VIII en las neoplasias vasculares; la ´proteína S-100 es positiva en liposarcomas, cordomas, condrosarcomas, schwanomas y sarcomas de células claras, y algunos de ellos como el cordoma coexpresan CK. En la Tabla_4 se muestra el diagnóstico diferencial de los sarcomas por ICQ.

El panel sugerido en el diagnóstico de sarcomas es:
• Vimentina positiva.
• CK y AME negativos en la mayoría de los sarcomas.
• Desmina positiva en miosarcomas.
• S-100 positiva en algunos tipos.

Tumores de células redondas, pequeñas y azules en niños (TCPRA). Fig_12 y fig_13
Estas neoplasias constituyen un grupo heterogéneo y de comportamiento biológico variado. Por solo morfología puede ser muy difícil diferenciarlos; en un estudio realizado a 51 casos de estos tumores se demostró la utilidad de la ICQ en el diagnóstico diferencial. (17)
El ACL es de gran utilidad para diferenciar linfomas de otros TCRPA, con excepción del linfoma anaplásico, que coexpresa además CK; el Mic-2 es altamente sensible y específico para los tumores neuroectodermicos/sarcoma de Ewing , pero no puede ser utilizado para distinguir entre ambas entidades. (4)
Los neuroblastomas son positivos para neurofilamentos y para el Ac del neuroblastoma, NB84. Los rabdomiosarcomas son positivos para marcadores musculares y vimentina.
No existen marcadores específicos para el tumor de Wilms ya que son positivos para vimentina, CK, AME y ENE; hay que tener en cuenta que estos tumores pueden tener una diferenciación divergente y un inmunofenotipo anómalo. (5)
En la Tabla_5 se detalla la expresión de marcadores en los TCPRA.

Inmunocitología de los derrames:
La relevancia clínica de la ICQ en los derrames es mayor en los pacientes en los que no se tiene el diagnóstico de malignidad, cuando se sospecha una metástasis o bien en el diagnóstico diferencial entre proceso reactivo y mesotelioma.
El líquido puede procesarse por extendido directo, citocentrifugado o por bloque celular; la combinación de estos aumentan la sensibilidad, pueden fijarse en alcohol, y las secas al aire en formol–solución salina al 0-1%.
La clave para el diagnóstico es reconocer las células mesoteliales benignas; estas se disponen en grupos pequeños, tienen una relación N/C pequeña y comúnmente el extendido muestra células inflamatorias y fibrina. Las células mesoteliales reactivas exhiben un amplio espectro morfológico: células con anisocitosis y anisonucleosis, se pueden disponer en grupos tridimensionales que recuerdan un adenocarcinoma, o presentar vacuolas degenerativas que simulan células en anillo de sello; el núcleo puede ser hipercromático o bien tener nucleolo prominente; con frecuencia las células mesoteliales exhiben endo y exocitoplasma en donde el primero aparece mas denso que en la periferia. En el mesotelioma estos rasgos se conservan, incluyendo uniones de tipo ventana debidas a microvellosidades largas entre las células. La ultraestructura ha sido considerada el estándar de oro para el diagnóstico. No obstante, en los mesoteliomas pocos diferenciados la ICQ puede ser de gran ayuda. (18) , (19)
En un estudio efectuado a 1548 derrames, el 86% de las ascitis fueron adenocarcinomas principalmente de ovario, el 78% de los líquidos pleurales positivos fueron adenocarcinomas de pulmón, seguidos de carcinomas mamarios, y en un pequeño número de casos el primario fue desconocido. Con base a estos hallazgos se debe elegir un panel razonable de ICQ para los derrames malignos o sospechosos. (2) , (3) , (18) , (19) , (20) Fig_14.

Los carcinomas de pulmón pueden diferenciarse por IHQ de un mesotelioma mediante su fuerte reactividad para ACE, además de positividad nuclear para TTF-1; este Ac tiene una sensibilidad para carcinoma escamoso del 10-30%, para carcinoma de células no pequeñas del 66%, y del 90% para células pequeñas; además es negativo en carcinoma de mama y en mesoteliomas.

En el caso de los mesoteliomas estos son fuertemente positivos para AME al contrario de las células mesoteliales que son negativas o débilmente positivas solo en el 3 al 4%. Este marcador no puede distinguir carcinoma de mesotelioma, pero si de un proceso reactivo; no obstante, con un panel que incluya AME, ACE y B72.3 se puede discriminar la presencia de un carcinoma metastático.21
Muchos tipos de carcinomas son positivos para ACE, sin embrago, el mesotelioma y las células mesoteliales reactivas no lo son. La sensibilidad para detectar adenocarcinoma va de un 50 a un 80%; la diferencia probablemente se deba a los diferentes adenocarcinomas que estudiados en las diferentes series. Altas concentraciones de ACE en derrames utilizando inmunoensayo es virtualmente diagnóstico de carcinoma metastático, con solo cerca de 9% de falsos positivos; se debe tener en cuenta que los carcinomas renales y prostáticos son negativos.
Tablas 6 y 7: Panel de anticuerpos para el estudio de los derramen.

Marcadores de significado pronóstico en ICQ:
Algunos marcadores de ICQ pueden dar información sobre el grado del tumor y esta información puede ser de relevancia en la planeación del tratamiento. Fig_15.
Marcadores de Proliferación:
• Anticuerpos contra antígenos de proliferación han demostrado tener significado pronóstico en algunos tumores como: Ki67 en carcinoma de mama, cuya expresión se relaciona con negatividad para reaccionar a receptores de estrógenos,22 o con los AgNORs que permiten discriminar LNH de alto y bajo grado.
• Factor de crecimiento epidérmico (EGFR): En el caso del carcinoma gástrico solo el 3.8% son positivos cuando están en etapa temprana, contra el 34% en etapas avanzadas. En carcinoma de mama, la sobrevida libre de enfermedad y la sobrevida total es menor cuando el EGFR es positivo. (2)
Receptores de estrógenos:
Este marcador es muy importante para predecir el comportamiento biológico, vaticinar recurrencias, y planeación del tratamiento, idealmente, los extendidos deben estar fijados en formol, acetona o metanol para mejores resultados. La sensibilidad es cercana al 100% y la especificidad es de 94%. (23). Las ventajas de efectuar estos marcadores en citología son que, al igual que en tejido,se pueden predecir recurrencias, desarrollo de metástasis, y respuesta a tratamiento, con un procedimiento menos invasivo que la biopsia, con la ganancia adicional de que puede ser repetido múltiples veces durante el tratamiento. (24) , (25)
Oncogenes:
La amplificación de N-myc en el neuroblastoma y del Her2neu en el carcinoma de mama se han relacionado con un menor tiempo libre d enfermedad, rápida recurrencia, y menor sobrevida global (26); de igual forma es posible la determinación de p53. (27)

En la Tabla_8 se muestran los resultados de los marcadores de pronóstico para carcinoma mamario en citología, con la concordancia cito-histológica.

Metástasis:
La utilidad de la IHQ para establecer sitio primario de las neoplasias ha sido demostrada en muchos órganos, principalmente para carcinomas prostáticos, tiroideos, pulmonar, hepático, entre otros, además de melanomas.
En la tabla 9 se enlistan los principales anticuerpos de ayuda para establecer histogénesis en una metástasis de origen desconocido. (4)

Experiencia del Hospital Universitario “Dr. José E. González” en Inmunocitoquímica.
En un estudio prospectivo de 406 casos consecutivos de especimenes citológicos estudiados con inmunocitoquímica para diagnóstico obtuvimos los siguientes resultados:
• En 156 (38.4%) casos se contó con correlación histológica.
• En el 78% la ICQ contribuyó al diagnóstico.
• En 6% no contribuyó al diagnóstico.
• El problema más frecuente para solicitar ICQ (29%) fue establecer diagnóstico de metástasis.
• En 17% de los casos fue realizar panel de pronóstico, principalmente en los casos de carcinoma mamario.
• En 16% no fue posible establecer la variedad exacta de neoplasia.

Tabla_10: ICQ en el Hospital Universitario, Monterrey, México.
Tabla_11: Contribución de la ICQ en el diagnóstico, comparación de series publicadas.

En conclusión, el uso de la inmunocitoquímica es una ayuda diagnóstica que ha demostrado, al igual que en la patología quirúrgica, ser altamente sensible y específica, que nos ayuda a confirmar un diagnóstico presuntivo por microscopía de luz, y solo en un pequeño porcentaje, a descartar lo inicialmente pensado por morfología.
Sin embargo, de la misma forma que en la patología quirúrgica, el estudio morfológico en conjunto con la correlación clinco-patológica y la experiencia, logran establecer un diagnóstico correcto; ninguna cantidad de inmunotinciones puede hacer llegar al diagnóstico correcto si no se combina con lo anteriormente dicho.