Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica
ISBN: 978-84-692-76778

COMUNICACIONES

1844.

Colágeno 11: nuevo marcador en el cáncer de mama.

NELSON FUENTES MARTINEZ[1], MARIA DEL CARMEN GARCIA PRAVIA[2], LUIS BARNEO SERRA[2], JOKIN DEL AMO[3], JUAN RAMON DE LOS TOYOS[4]
(1) HOSPITAL NUESTRA SEÑORA DEL PRADO ESPAÑA
(2) HOSPITAL CENTRAL DE ASTURIAS ESPAÑA
(3) PROGENIKA S.A ESPAÑA
(4) DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE OVIEDO ESPAÑA

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Introducción: El diagnóstico diferencial entre  adenosis esclerosante y carcinoma ductal infiltrante de mama mediante técnicas histoquímicas convencionales puede plantear problemas ocasionalmente, de ahí que el desarrollo de herramientas inmunohistoquímicas que ayuden a este propósito, son de importancia. El objetivo de nuestro trabajo fue probar la expresión  de procolágenoXIA1 en fibroblastos de la desmoplasia del cáncer de mama, y la ausencia o baja expresividad del mismo, en fibroblastos de  lesiones benignas esclerosantes mamarias.
Metodos: Muestra compuesta por 52 casos de lesiones benignas de mama y 51 casos de carcinoma mamario infiltrante,  los cuáles se sometieron a tinción inmunohistoquímica, para lo cuál se uso un anticuerpo policlonal AntiCol11A1-T altamente específico, dirigido contra la fracción menos homóloga del procolágeno11A1 en comparación con el resto de procolágenos. Los resultados fueron validados mediante RT-PCR, en el equipo Light-Cyrcle Sybr-Green del laboratorio Progenika Bilbao.
Resultados: El procolágeno11A1 se sobreexpresó  significativamente en carcinoma mamario, en comparación con lesiones esclerosantes benignas de mama.
Conclusiones: El AntiCOL11A1-T, puede ser utilizado como marcador inmunohistoquímico, para distinguir entre carcinoma mamario infiltrante y lesiones esclerosantes benignas de mama, en particular entre carcinoma ductal infiltrante y adenosis esclerosante

 

Introducción    

El cáncer de mama es la neoplasia con mayor tasa de incidencia y mortalidad entre las mujeres, de ahí que su diagnóstico precoz y tratamiento sean de vital importancia.  En los últimos años, con la introducción de la genética en la medicina (en especial en la oncología médica), se han hecho diversos descubrimientos que influyen en el pronóstico y tratamiento del cáncer de mama,  los cuales han llevado a reclasificar esta patología en cuanto a su perfil genético; los descubrimientos más significativos se han hecho acerca del componente epitelial de estos tumores, fundamentalmente los  factores de crecimiento epidérmico (EGFr y Her-2), que se han convertido en dianas  terapéuticas al igual que los receptores de estrógenos y progesterona. Además, se han desarrollado una serie de marcadores inmunohistoquímicos,  de gran  utilidad para diferenciar entre lesiones benignas y malignas en los casos en que las técnicas histoquímicas convencionales son insuficientes.

Estudios previos de nuestro equipo de trabajo, demostraron la expresión diferencial  del gen  colágeno11A1  entre lesiones malignas y benignas de páncreas e igualmente la expresión diferencial de la proteína que codifica este gen,  a través de un anticuerpo policlonal (AntiCOL11A1) generado por nosotros. Existen estudios similares a nivel genético, en colon, cáncer no microcítico de pulmón y carcinoma escamoso de cabeza y cuello. El colágeno11 es uno de los más de veinte subtipos del colágeno, uno de los componentes fundamentales  de la matriz extracelular, que junto con los fibroblastos y las células inflamatorias constituyen la llamada  desmoplasia tumoral propia de los tumores infiltrantes .

 

Basándonos en estos estudios, hemos decidido comparar la expresión genética del COL11A1(mediante RT-PCR) y proteica (mediante inmunohistoquímia, con el anticuerpo AntiCOL11A1, generado en el estudio de páncreas) en carcinoma ductal infiltrante y adenosis esclerosante de la mama, ya que, el diagnóstico diferencial entre  estas patologías mediante técnicas histoquímicas convencionales puede plantear problemas ocasionalmente.

 

Hipótesis    

El gen COL11A1 se expresa en carcinoma escamoso de cabeza y cuello, en carcinoma no microcítico de pulmón, y en cáncer de colon.

Nuestro grupo de trabajo investigó la expresión del gen COL11A1 en adenocarcinoma ductal pancreático y pancreatitis crónica, tanto a nivel molecular como inmunohistoquímico, encontrando una expresión diferencial entre ambos tipos de lesiones. En el curso de esta investigación se generó un anticuerpo policlonal antiprocolágeno11A1, que tiñó el citoplasma de los fibroblastos de la reacción desmoplásica del cáncer, siendo negativa la tinción en el estroma de gran parte de los casos de pancreatitis crónica. 

Se ha demostrado un aumento de la expresión del gen COL11A1 en el componente mioepitelial del cáncer mamario, pero hasta la actualidad no se ha desarrollado un anticuerpo que permita demostrar la expresión de esta proteína mediante inmunohistoquímica.

El anticuerpo antiprocolágeno11A1 generado por nuestro grupo nos permite estudiar la expresión de la proteína en patología mamaria. Con esta base queremos probar  la validez del anticuerpo para el diagnóstico diferencial de lesiones límite entre benignidad y malignidad. 

 

Objetivos    

1-Demostrar la expresión inmunohistoquímica de la proteína procolágeno11A1, a través del anticuerpo policlonal AntiCOL11A1 en cáncer de mama.

2-Comparar la expresión del gen COL11A1 en lesiones malignas mamarias infiltrantes y lesiones benignas esclerosantes a través de RT-PCR e inmunohistoquímica.

3-Validar el anticuerpo policlonal AntiCOL11A1 como marcador inmunohistoquímico para diferenciar lesiones   infiltrantes  malignas  y  benignas esclerosantes  de    mama.

 

Material y Métodos    

Muestras de tejidos: Muestra de 103 casos, constituida por  52 casos de lesiones benignas de mama, y 51 casos de carcinoma infiltrante, seleccionadas del archivo de biopsias de Anatomía Patológica del Hospital Universitario Central de Asturias,  correspondientes a cilindros de tejido mamario   obtenidos  por  BAG .

 

De los casos benignos, 38 correspondían a adenosis esclerosante(AE), 5 casos a AE asociada a fibroadenoma(FA), 1 caso asociado a mastopatía fibroquística (MFQ) y 1 asociado a hiperplasia epitelial típica (HT); 4 casos de FA, 1 caso de  HT, 1 caso de mastopatía compleja (MC) y por último 1 caso de reacción a cuerpo extraño. De los 51 casos malignos, 49 casos correspondían a carcinoma ductal infiltrante (CDI), dentro de ellos  1 casos de la  variante coloide (CDC) y 1 caso de la apocrina (CDA);  1 caso correspondía a carcinoma lobulillar(CL) y  por último 1 caso a sospechoso de malignidad(SM).

 
Anticuerpo policlonal: Se obtuvo un anticuerpo policlonal AntiCOL11A1-T en la Universidad de Oviedo, en el departamento de inmunología, por el Dr J.R. De los Toyos. Se inyectó intramuscularmente a conejos  blancos New Zeland con intervalos de 2 semanas con 2 ml de solución inmunógena, la cuál contenía la proteína COL11A1-T codificada por una fracción  de DNA del gen COL11A1, sintetizada in Vitro mediante LCR-PCR, a través del ensamblaje de oligonucleótidos que sintetizaban para la secuencia de aminoácidos menos homóloga del COLXIA1 con respecto a otros colágenos, la cuál a su vez, coincidía con la región más hidrófila del COL11A1(E268 - E400). A las dos semanas de la última inmunización, los conejos fueron anestesiados, y desangrados a muerte a través de punción cardíaca; del suero de los mismos se obtuvo el anticuerpo policlonal sobrenadante.

 
Análisis inmunoshistoquímico: De todas las muestras se realizaron 3 cortes de 3 micras, uno se utilizó para hematoxilina-eosina, el segundo para la tinción inmunohistoquímica con p63 y el tercero para la tinción con AntiCOL11A1-T  diluido a 1:2000 en buffer S2022 y usando el método de revelado EnVision (Dako).

 

Los resultados fueron evaluados por dos patólogos por separado, tomando en cuenta dos parámetros:

 

Número de campos positivos de 10X (NCP): Se tomaron 4 campos de 10 X, los cuáles  correspondían a los de mayor extensión e intensidad  de tinción, dando una escala de valores entre 4 y 0 en dependencia de la cantidad de campos positivos, en los casos cuya totalidad de campos era inferior o igual a 4, se evaluaron todos ellos.

Porcentaje de células teñidas en relación a la superficie estromal (%C/SE): Se eligió un campo de 20X correspondiente al de mayor superficie e intensidad de tinción,  puntuando con  1 a los casos con menos del 10 %  de células positivas en relación a la superficie estromal, con 2 a los casos con positividad entre el 10-50 % y con 3 a los que presentaban mas del 50 % de positividad.

 

 

Análisis de Imagen: Se realizó  en 36 casos benignos y 32 casos malignos del total de 103 casos. De los 36 casos benignos , 22 casos correspondían a AE, 7 casos a AE asociada a otra patología benigna, 4 casos a FA,1 caso a HT, 1 caso a MC y 1 caso a reacción a cuerpo extraño. De los 32 casos malignos, 30 casos correspondían a CDI, 1 caso a CL  y 1 caso a SM. El análisis de imagen se realizó en el equipo Leica Q550 Quantimet 2 de la Facultad de Medicina de Oviedo diseñando una macro que discriminaba entre células teñidas y no teñidas. Las imágenes  fueron tomadas en el fotomicroscopio automatizado Olympus-BX61 de esta misma facultad, fotografiando los campos de mayor intensidad y superficie de tinción, en los casos que tenían 4 o menos campos en total, se fotografiaron todos ellos. Los parámetros a valorar fueron: número de células positivas(NCeP), número de células positivas por mm2(NCeP/MM2) y superficie positiva(SP).

 

PCR: Se obtuvieron mediante BAG, 14 muestras de tejido mamario, 8 correspondientes a casos benignos, y 6 a casos malignos, fueron congeladas inmediatamente después de su extracción a -80ºc y enviadas a Progenika-Bilbao, se extrajo el RNA de las mismas, homogenizando el tejido en Trizol Reagent (Life Technologies, Carlsbad, USA), un reactivo con fenol e isotiocianato de guanidina, para posteriormente a través de una transcriptasa reversa obtener el DNA de la muestra. Se desarrollaron dos parejas de primers, uno para el gen diana COL11A1 y otro para el gen de referencia PUM1(Maria B Lyng et al.,2008), siendo ambos validados. El  análisis de RT-PCR, se realizó en el equipo Light-Cyrcle Sybr-Green. Estas muestras están incluidas en el estudio inmunohistoquímico.

 

 

Resultados y Discusión    

                                                                RESULTADOS

 

Para valorar los resultados inmunohistoquímicos obtenidos a través de microscopia óptica, primeramente correlacionamos los datos de ambos patólogos, a través del Coeficiente de correlación de Spearman. En los casos benignos, el coeficiente de correlación para el NCP fue 0,945, siendo p<0,0001  y de 0,9575 para el %C/SE, con una p<0,0001. En los casos malignos el Coeficiente de Correlación para el NCP fue de 0,7476 y de 0,7878 para el %C/SE con una p<0,0001.

 

Una vez  demostrada la alta correlatividad   entre ambos patólogos, se realizó el análisis estadístico con la media de los valores obtenidos por ambos, comparando casos benignos y malignos. El test de Mann-Whitney demostró en los casos benignos que la mediana para el  NCP se situó en 0 (valor mínimo), sin embargo los casos malignos presentaron una mediana de 1 (valor máximo), siendo p<0,0001. La mediana para el %C/SE en los casos benignos fue de 0 (valor mínimo) y en los casos malignos de 3 (valor máximo), siendo p<0,0001.

 

El estudio comparativo de sensibilidad y especificidad mediante Curva ROC, demostró que tanto NCP como %C/SE, tenían una alta especificidad y sensibilidad, con un área bajo la curva de 0,982 y 0,97 respectivamente. Estimamos más útil para la práctica diaria del patólogo  el NCP, observando que este discriminaba entre lesiones benignas y malignas con una sensibilidad de 94,1 y una especificidad de 96,2. (Figura 1)

 

El análisis de imagen demostró igualmente, una alta sensibilidad y especificidad, corroborando mediante curva ROC, que todos los parámetros analizados discriminaban similarmente entre lesiones benignas y malignas, con áreas bajo la curva que se acercaban significativamente. Consideramos el NCeP, el parámetro más útil para la práctica diaria del patólogo, demostrando este una sensibilidad de 91,4   y una especificidad de  96,9   en la discriminación entre lesiones benignas y malignas.  (Figura 2)

 

Al separar los casos de AE y CDI, apreciamos que los valores de sensibilidad y especificidad fueron más altos,  siendo para el  NCP de 93,1 y 100 respectivamente (Figura 3) y para  el NCeP de 95,56 y 97,96 respectivamente (Figura 4).

 

En la figura 5 mostramos un caso típico de adenosis esclerosante y carcinoma ductal infiltrante, en la que podemos apreciar la positividad en el  caso maligno y negatividad en el caso benigno y a su vez, la imagen inversa que nos da la p63, la cual tiñe células mioepiteliales.

 

PCR : Se comprobó que la expresión del gen COL11A1, se encontraba sobreexpresado en carcinoma ductal infiltrante de mama, en comparación con lesiones benignas esclerosantes, siendo el cambio de expresión (fold change) de 18,7.

 

                                                                        DISCUSIÓN

 

El cáncer de mama es la neoplasia con mayor tasa de incidencia y mortalidad entre las mujeres, de ahí que su diagnóstico precoz y tratamiento sea de vital importancia. En los últimos años con la introducción de la genética en la medicina, en especial en la oncología médica, se han hecho diversos descubrimientos que influyen en el pronóstico y tratamiento del cáncer de mama, los cuáles han llevado a reclasificar esta patología en cuanto a su perfil genético; los descubrimientos mas significativos se han hecho acerca del componente epitelial de estos tumores, fundamentalmente los  factores de crecimiento epidérmico(EGFR Y Her 2), receptores de estrógenos y progesterona, existiendo actualmente dianas terapéuticas dirigidas a ellos, igualmente se han desarrollado técnicas inmunohistoquímicas, que son de gran  utilidad para diferenciar entre lesiones benignas y malignas, que a través de  técnicas histoquímicas convencionales sería ocasionalmente dificultoso.

 

En la mama existen lesiones benignas esclerosantes, principalmente la AE y la cicatriz radial, que en ocasiones, debido a su patrón morfológico  plantean dificultad en el diagnóstico diferencial con lesiones malignas infiltrantes, tales como el carcinoma tubular y CDI, esta situación es aún mas compleja en BAG, ya que al no existir una representación total de la lesión, no podemos apreciar los contornos de la misma, lo cuál es una de las claves  para el diagnóstico diferencial, especialmente cuando no podemos reconocer las células basales mioepiteliales presentes en las lesiones benignas y ausentes en las malignas infiltrantes. Existen técnicas inmunohistoquímicas, tales como la p63, α-actina, miosina de cadenas pesadas para músculo liso, calponina, s100, CD10,  que tiñen las células mioepiteliales de los conductos mamarios, ayudandonos a diferenciar entre este tipo de lesiones. Dentro de estos marcadores, la α-actina, miosina de cadenas pesadas para el músculo liso y  calponina, presentan una  alta sensibilidad para las células basales mioepiteliales, sin embargo, no son específicas de estas, tiñendo igualmente a  las células musculares lisas vasculares y los miofibroblastos estromales,  similares problemas se plantean con s100 Y CD10( M.Lerwill,2004).

 

 En una serie de casos correspondientes a AE, CDI, CL y carcinoma ductal in situ Werling RW y colaboradores, analizaron el patrón de reactividad de los anticuerpos p63, Miosina de músculo liso y calponina, demostrando que todos ellos tiñeron  las células mioepiteliales de los casos benignos y malignos  no infiltrantes, sin embargo, corroboraron la positividad de miosina y Calponina en  miofibroblastos  y células musculares lisas vasculares, demostrando que p63  fue la que menor reactividad cruzada presentó con los fibroblastos estromales, sin teñir ninguno de ellos,  lo cuál reveló la   alta sensibilidad y especificidad de esta para teñir células mioepiteliales en comparación con el resto de anticuerpos estudiados, no obstante estableció como desventajas, la tinción en ocasiones discontinua de las células mioepiteliales, en particular en los carcinomas in situ, e igualmente la positividad focal hasta en un 11% de los casos, de las células tumorales.( Werling RW et al.,2003).

 

 

Actualmente la p63 es uno de los marcadores mas usados para el diagnóstico diferencial entre lesiones benignas esclerosantes y malignas infiltrantes de la mama, sin embargo hasta la fecha, no existe ningún marcador estromal que ayude a diferenciar entre estas lesiones, de ahí que el objetivo de nuestro trabajo lo hemos dirigido a validar el anticuerpo policlonal COLXIA1-T como marcador estromal de lesiones malignas infiltrantes mamarias, ya validado con anterioridad por nuestro equipo de trabajo como marcador estromal en el adenocarcinoma ductal pancreático y habiéndose demostrado hallazgos similares  en  adenocarcinoma colónico (Fisher H et al.,2001), carcinoma escamoso de cabeza y cuello(Sok,JohnC et al., 2003) y cáncer no microcítico de pulmón(Chong IW et al.,2006).

 

 

Nuestros resultados han demostrado una gran diferencia de expresión entre lesiones benignas y malignas, existiendo porcentajes de negatividad y positividad respectivamente altos, lo cuál traducido a nuestra muestra, revela una clara diferencia de expresión entre CDI y AE, ya que la mayor parte de ella esta representada por estas dos patologías, no obstante, podemos señalar que si bien los casos  correspondientes a FA y HE representaban una minoría de la muestra benigna, también ellos mostraron negatividad. En los casos malignos, apreciamos que solo un único caso mostró negatividad, correspondiendo a la variante histológica de CL, pero al tratarse de un caso aislado, no podemos deducir una  conclusión al respecto.

 

El COLXIA1-T, como marcador citoplasmático de fibroblastos de la reacción desmoplásica tumoral, resulta un nuevo hallazgo en el cáncer de mama, debido a ausencia   de un marcador estromal que diferenciara entre lesiones benignas esclerosantes y malignas infiltrantes de este órgano. La alta concordancia entre los resultados inmunohitoquímicos, análisis de imagen y RT-PCR, demuestran que nuestro marcador es altamente sensible y específico discriminando entre lesiones benignas esclerosantes y malignas infiltrantes de mama, en particular entre AE y CDI, pudiendo agregar la alta correlatividad entre patológos, la fácil evaluación del marcador mediante microscopía óptica, y la ausencia de tinción de elementos  epiteliales o vasculares. Los resultados obtenidos, nos han llevado a proponer el coctel inmunohistoquímico (COLXIA1-T/p63), frente al coctel propuesto por K.Pavlakis y colaboradores  (p63/SMA), ya que se trataría del primero  que teñiría  con una alta especificidad y sensibilidad, fibroblastos y células mioepiteliales, evitando así las reacciones cruzadas observadas con SMA, la cuál tiñe células mioepiteliales,  células de la musculatura lisa vascular y miofibroblastos , no obstante, existe la desventaja que el COLXIA1-T no tiñe a todos los fibroblastos de la reacción desmoplásica tumoral, dando lugar a  positividad focal, por lo que existiría la probabilidad de falsos negativos en muestras pequeñas de tejido, a pesar que en nuestro estudio todas las muestras de CDI , correspondientes a cilindros obtenidos mediante BAG, mostraron positividad para COLXIA1-T, resultando únicamente negativo un caso de CL, sin embargo en una serie de 21  casos de esta variante histológica estudiados por nuestro equipo de trabajo, procedentes de piezas quirúrgicas, pudimos corroborar la positividad focal de fibroblastos estromales.

 

Nuestros hallazgos  reabren  la interrogante sobre el  origen de los fibroblastos, debido a la existencia de diferencias en el patrón de expresión de estos, dentro de una misma población tumoral. Se ha  especulado sobre un bucle paracrino tumor-estroma-tumor, en el cuál la célula epitelial induciría un cambio de comportamiento en los fibroblastos estromales, creando estos un medio propicio para el crecimiento, diferenciación y angiogénesis tumoral.  Existen muchas otras teorías sobre el origen de los fibroblastos en los distintos tipos de tumores, se cree que los derivados del propio tejido que maligniza, juegan un papel fundamental en las etapas tempranas del desarrollo tumoral(A.Desmouliére and C.Guyot,2004), igualmente se cree que  los miofibroblastos de una herida, tienen su origen, debido a un reclutamiento local de fibroblastos, derivados de la dermis y el tejido celular subcutáneo adyacente a la misma(Ross et al.,1970), esta teoría tiene su origen en la presencia de muchos fibroblastos que muestran positividad nuclear para marcadores de proliferación en la perifería de la herida( Darby et al.,1997), otra posibilidad es el origen de los miofibroblastos en los pericitos o células musculares lisas vasculares de los vasos que rodean al tejido de granulación.

 

En los últimos años ha surgido  la evidencia de una célula precursora circulante que migra dentro de la herida, contribuyendo así a la población de fibroblastos del tejido de granulación (Abe et al.,2001), similar evidencia existe para células precursora endoteliales circulantes (Kalka el al., 2000). Bucala y colaboradores identificaron una nueva subpoblación de leucocitos con propiedades similares a los fibroblastos, la cuál fue denominada fibrocitos, estos pueden penetrar a la herida tan rápido como los elementos inflamatorios y juegan  un papel fundamental  en lesiones producidas por quemaduras, donde es difícil que los fibroblastos migren dentro de la herida(Yang et al.,2002)(Bucala et al.,1994). Hoy en día no existen conocimientos que confirmen  el papel de los fibrocitos en la reacción desmoplásica tumoral, pero es posible que esto ocurra a medida que aumente el tamaño tumoral. Recientemente se ha conocido que los fibroblastos derivados de la médula ósea  contribuyen a la reacción desmoplásica tumoral, mediante un estudio desarrollado en ratones con inmunodeficiencia combinada severa, implantándoles una  variante de cáncer pancreático humano, de la línea celular Calpain-1, el cuál indujo una intensa   reacción desmoplásica en los animales. Previamente al estudio, a los ratones se les sustituyó las células de la médula ósea por las de ratones transgénicos   con doble mutación para β-galactosidasa y deficiencia del gen 1 de la activación de la recombinación, los resultados indicaron que los fibroblastos que formaban parte de la reacción desmoplásica tumoral inducida, pertenecían a dos grupos, los no derivados de la médula ósea y los derivados de la misma, incorporándose estos últimos en las etapas más avanzadas de la reacción desmoplásica tumoral(Ishii et al.,2003). Finalmente durante la fibrogénesis renal se ha comprobado que los fibroblastos derivan en gran número de la transición local epitelial- mesenquimal( Kalluri and Neilson,2003,Liu,2004), demostrándose igualmente, que durante la fibrosis renal mas de un tercio de los fibroblastos, se originan del epitelio de los túbulos renales de alrededor de la lesión(Iwano et al.,2002).

 

Finalmente podemos concluir que los parámetros estudiados, todos ellos, mostraron elevados y similares porcentajes de sensibilidad y especificidad, discriminando así entre malignidad y benignidad, y en particular entre AE Y CDI, de ellos seleccionamos el NCP y NCeP, como los dos parámetros mas prácticos para interpretar por el patólogo, tanto por microscopia óptica, como por análisis de imagen , los cuáles demostraron una sensibilidad de 94,1 y 91,4 y una especificidad de 96,2 y 96,9 respectivamente. Estos resultados mostraron una sensibilidad y especificidad aún mas alta, al comparar exclusivamente los casos de AE y CDI, siendo para el NCP de 93,1 y 100 respectivamente y para  el NCeP de 95,56 y 97,96 respectivamente.

 
 

 

  Figura 1: Curva ROC para en Número de campos positivos
Figura 1: Curva ROC para en Número de campos positivos


  Figura 2: Curva ROC para el Número de células positivas. Ánalisis de imagen.
Figura 2: Curva ROC para el Número de células positivas. Ánalisis de imagen.


  Figura 3: Curva ROC para adenosis esclerosante y carcinoma ductal infiltrante. Número de campos positivos
Figura 3: Curva ROC para adenosis esclerosante y carcinoma ductal infiltrante. Número de campos positivos


  Figura 4: Curva ROC para adenosis esclerosante y carcinoma ductal infiltrante. Número de células positivas.
Figura 4: Curva ROC para adenosis esclerosante y carcinoma ductal infiltrante. Número de células positivas.


  Figura 5: A: Hematoxilina- eosina de CDI 10X. B:Hematoxilina-eosina  AE  10X. C: AntiCOL11A1-T de CDI 20X. D: AntiCOL11A1-T de AE 20X. E: p63 de CDI 
20X. F: p63  de AE 20X.
Figura 5: A: Hematoxilina- eosina de CDI 10X. B:Hematoxilina-eosina AE 10X. C: AntiCOL11A1-T de CDI 20X. D: AntiCOL11A1-T de AE 20X. E: p63 de CDI 20X. F: p63 de AE 20X.




Agradecimientos    

Estoy especialmente agradecido:

 

-       A mis directores la Dra  María del Carmen García Pravia y el Dr Luis Barneo Serra,  por las horas dedicadas. Gracias Carmen, por tu sencillez y modestia, por confiar en mí, por abrirme la puerta, que me parecía imposible abrir. Gracias Luis, por permitirme pertenecer a este maravilloso equipo, por tu perfeccionismo y experiencia como investigador, me ha ayudado a mejorar como profesional.

 

-       Al Dr Jokin del Amo y a Progenika  S.A.;  por su profesionalidad,  porque sin su trabajo este proyecto hubiera sido imposible,  permitiendo con su Tesis Doctoral, que otros profesionales como yo, nos iniciemos en el mundo de la investigación.

 

-       Al Dr Juan de los Toyos  porque,  habiendo  participado con el Dr. del Amo  en su Tesis Doctoral, ha  generado el Anticuerpo AntiCOL11A1, uno de las principales herramientas utilizadas en este trabajo.

 

-       Al Dr Manuel Florentino Fresno Forcelledo  Jefe  de  Anatomía Patológica del Hospital Universitario Central de Asturias, por haberme permitido utilizar los medios de este servicio.

 

-       A la Dra Ana Díaz y la Dra Encarnación Nava del servicio de Radiología del Hospital Universitario Central de Asturias, por su colaboración en la obtención de tejido fresco mamario para realizar la PCR.

 

-       A Laura Sánchez Fernández  técnica de laboratorio encargada de procesar todas las muestras analizadas en este trabajo, por su esfuerzo y gran    trabajo.

 

 

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