Citología intraoperatoria

Javier Saenz de Santamaría^[1], Cesar Lacruz Pelea^[2], Inmaculada Catalina Fernández^[3], Jose Juan Fernández de Mera^[3], Dolores Lopez Presa^[4]
(1) Complejo Hospitalario Universiatario. Badajoz. ESPAÑA
(2) Hospital General Universitario Gregorio Marañon. Madrid. ESPAÑA
(3) Complejo Hospitalario Universitario. Badajoz. ESPAÑA
(4) Hospital Santa María. Lisboa. PORTUGAL

Resumen

A principios del siglo diecinueve, las muestras citológicas se usaban como ayuda para el diagnóstico de lesiones procedentes de resecciones quirúrgicas, principalmente tumorales.

Leonard S. Dudgeon, informa por primera vez de una técnica citológica rápida para el estudio intraoperatorio de especímenes  quirúrgicos. Sus muestras, a las que denominó “wet films”, se realizaban mediante raspado con bisturí de la superficie de las piezas quirúrgicas y posterior extensión del material obtenido en un portaobjetos.

Las muestras citológicas se obtienen, habitualmente, mediante tres procedimientos: raspado (“wet-film” de Dudgeon), improntas (“touch-preps”) y aplastamiento-extensión (“squash”).

Las muestras obtenidas se fijan inmediatamente con etanol al 95% (fijación húmeda) o se dejan secar al aire. Las muestras húmedas son susceptibles de tinciones de Papanicolaou y las secas, se tiñen con tinciones de Romanovsky.

Discusión    

RESUMEN HISTÓRICO

A principios del siglo diecinueve, antes del desarrollo de las técnicas de sección histológica o del uso generalizado de microtomos, las muestras citológicas se usaban como ayuda para el diagnóstico de lesiones procedentes de resecciones quirúrgicas, principalmente tumorales. No es hasta mediados del siglo diecinueve cuando la histología empieza a sustituir a la citología en el diagnóstico de piezas quirúrgicas. Incluso entonces, algunos eminentes patólogos como Virchow, sus alumnos y, más tarde, James Ewing, continúan usando ambas técnicas. Sin embargo, la histología llegó a utilizarse casi de forma exclusiva para el diagnóstico. En 1922, la actitud adoptada predominantemente es la expresada por Bland-Sutton: “In the appearance of a cell from cancer there is nothing characteristic of the disease, nothing that would lead a pathologist to identify it as a malignant cell. Cancer can only be identified in sections showing the relation of cells to each other in a group”. A pesar de que los estudios pioneros de Papanicolaou, Dudgeon y otros investigadores demostraban hechos contrarios, estas actitudes predominaron hasta que Papanicolaou y Traut publicaron su monografía en 1943.

Las secciones por congelación no empezaron a ser ampliamente utilizadas hasta cuarenta años después de que Welch en 1891, introdujera la técnica. En 1927, el profesor Leonard S. Dudgeon,  decano del San Thomas´s Hospital Medical School y uno de los líderes médicos más respetados de Londres, informa por primera vez de una técnica citológica rápida para el estudio intraoperatorio de especimenes  quirúrgicos. Sus muestras, a las que denominó “wet films”, se realizaban mediante raspado con bisturí de la superficie de las piezas quirúrgicas y posterior extensión del material obtenido en un portaobjetos. Las extensiones eran fijadas inmediatamente (sin permitir que se secaran) durante dos a diez minutos en fluido de Schaudinn (un fijador constituido por dos partes de solución saturada mercurial clorhídrica, una parte de alcohol absoluto y suficiente ácido acético glacial para formar una solución al 4% que Dudgeon había usado para estudiar parásitos en extensiones de heces) y teñidas mediante técnica rápida de hematoxilina y eosina. Examinadas treinta años después, las extensiones muestran excelentes condiciones y aún adecuadas para la realización de microfotografías.

Después de que Dudgeon y Patrick publicaran un estudio inicial de 200 muestras en 1927, en 1934 Dudgeon y Barret describieron sus resultados con 1000 muestras. De 469 extensiones de lesiones malignas, 462 fueron correctamente diagnosticadas.

Dudgeon fue uno de los fundadores del diagnóstico citológico contemporáneo y merece un gran reconocimiento. Poco se ha añadido a su descripción de 1934 sobre las características citológicas de malignidad. Además de introducir la citología intraoperatoria, instituyó junto  a C. J. Wrigley el primer estudio sistemático citológico de esputo en pacientes con sospecha de cáncer de pulmón. Así, fueron capaces de demostrar células tumorales en dos tercios de las muestras examinadas de pacientes en los que posteriormente se confirmaría el diagnóstico de cáncer de pulmón.

En 1932, A. J. Wrigley, compañero de Dudgeon en el St. Thomas Hospital, publicó sus resultados con muestras ginecológicas empleando la técnica de “wet-film”. La presencia o ausencia de células tumorales fue identificada correctamente en cada muestra.

MÉTODOS DE PREPARACIÓN

Las muestras citológicas se obtienen, habitualmente, mediante tres procedimientos. La técnica que obtiene células mediante raspado del tejido con posterior extensión en portaobjeto (“wet-film” de Dudgeon). La biopsia en fresco es seccionada una o varias veces y la superficie de corte se raspa con una hoja de bisturí o el canto de un portaobjetos. El raspado es extendido con un segundo portaobjetos del mismo modo como se hace en los extendidos hematológicos. El primer raspado tras la sección del tejido suele contener la mejor celularidad, pero si el tejido es muy hemático, como el tiroides,  conviene eliminar sangre de la superficie de corte antes de tomar la muestra. Los tejidos de consistencia blanda como los ganglios linfáticos, deben rasparse con cuidado y los tejidos firmes o fibróticos deben ser raspados enérgicamente y suelen obtenerse buenas muestras sin distorsión del tejido para estudios histológicos posteriores.

Las improntas (“touch preps”), preferidas por algunos patólogos, pueden ser la única técnica posible en casos de muestras muy pequeñas, blandas o fragmentadas. Las improntas se hacen presionando firmemente la superficie de corte del tejido contra el portaobjetos (o presionando el portaobjetos sobre el fragmento o fragmentos). Algunos autores consideran que no debe moverse el portaobjetos mientras se realiza la presión para no distorsionar la celularidad, otros, sin embargo, no consideran esto un problema.

Un tercer tipo de preparación citológica muy útil en biopsias pequeñas, blandas y altamente celulares, como tumores cerebrales, es la técnica por aplastamiento-extensión (“squash”). Un pequeño fragmento de tejido, normalmente de un milímetro cúbico, se dispone en un portaobjetos y con un segundo portaobjetos se ejerce suficiente presión entre ellos para extender el tejido entre ambos.

Cada técnica tiene ventajas específicas y un método es mejor que otro dependiendo del tipo de muestra.

La impronta puede ser el único método para obtener preparaciones satisfactorias de muestras fragmentadas, pequeñas o de tejidos muy blandos. De estos tejidos se pueden obtener magníficas muestras, sin embargo de tejidos fibróticos o demasiado firmes se obtiene una escasa representatividad celular.

La técnica de aplastamiento tiene un uso más limitado, pero proporciona excelentes preparaciones. Se usa normalmente para estudiar biopsias procedentes de tumores cerebrales. Esta técnica también ha demostrado su utilidad en otros tumores de partes blandas.

FIJACIÓN

La fijación inmediata (fijación húmeda) en etanol (habitualmente al 95%) seguida por tinciones con hematoxilina y eosina o modificaciones de éstas, como la de Papanicolaou, proporcionan los mayores detalles nucleares. Además, las preparaciones fijadas y teñidas de este modo, pueden ser comparadas con las secciones histológicas procesadas de un modo similar. Este método es el habitualmente utilizado en America del Norte, pero en Europa es más habitual el empleo de preparaciones secadas al aire, con resultados semejantes.

Las muestras secadas al aire y teñidas con técnicas de Romanovsky, ofrecen algunas ventajas, sobretodo la presentación mucho más clara de las características citoplásmicas y elementos extracelulares metacromáticos.

El paso más crítico en las muestras húmedas es la necesidad de una inmediata fijación. Se requiere menos de un segundo para que una extensión o una impronta se sequen, artefactando el resultado. Aquellos que se detienen para admirar su obra la arruinan. Normalmente la extensión se hace en proximidad a un Coplin lleno de alcohol donde se introduce inmediatamente el portaobjetos. La fijación tan solo requiere 15 segundos e incluso menos. El etanol es el  fijador más ampliamente usado, sin embargo también se han empleado el metanol y el alcohol isopropilo.

PREPARACIONES SECADAS AL AIRE

A las preparaciones secadas al aire y teñidas con métodos de Romanovsky, evidentemente no les afecta el retraso hasta el momento de la fijación. Sin embargo, se requieren varios minutos para un secado completo a no ser que se use algún método para acelerar el proceso.

La técnica de Diff-Quik^®, es una técnica rápida de tinción de tipo Romanovsky, consiste en tres soluciones: un fijador alcohol metilo, una solución acuosa de eosina  y una solución acuosa de azul metileno y azure A. La muestra citológica es sumergida en cada solución, en el orden descrito, agitada brevemente y dejada en cada solución entre 15 y 20 segundos. Después de la tinción se lava con agua. Para un estudio microscópico inmediato se puede colocar un cubreobjetos sobre la muestra húmeda.

Aunque los extendidos sanguíneos o las extensiones de muestras obtenidas mediante punción aspiración con aguja fina pueden ser teñidas en tan sólo 15 segundos  con Diff-Quik^®, los extendidos o improntas procedentes de estudios intraoperatorios, suelen presentar mayor espesor, por lo que pueden necesitar mayores tiempos para una óptima tinción.

OTRAS TINCIONES

Otras tinciones rápidas como el azul de metileno y el cristal violeta, también se han usado con éxito, tanto en preparaciones húmedas como secadas al aire.

Los hongos se demuestran con azul alcián, ácido peryódico de Schiff y metenamina de plata, pero presentan una marcada fluorescencia con luz ultravioleta cuando se tiñen con eosina. Las tinciones rápidas ácidas o la tinción de rodamina para la identificación de bacilos acido alcohol resistentes, son iguales de efectivas y rápidas.

Finalmente, las extensiones fijadas al aire son excelentes para la mayoría de estudios inmunohistoquímicos.

VENTAJAS DE LA CITOLOGÍA INTRAOPERATORIA

Todos los patólogos que han utilizado la citología como ayuda para un rápido diagnóstico intraoperatorio le encuentran una utilidad incuestionable.

DETALLE CITOLÓGICO (Figs. 7-10, 18-23)

Indudablemente, la mayor ventaja de la citología intraoperatoria es la capacidad para discernir el detalle celular. Las células se fijan inmediatamente y no se retraen como ocurre con los estudios en parafina ni se distorsionan por la congelación o el corte tisular. Detalles delicados de la estructura nuclear como la calidad de la cromatina, el engrosamiento del anillo cromatínico y las irregularidades de los límites nucleares y nucleolares son fácilmente apreciables. La capacidad para detectar tales anomalías de la estructura nuclear hace mucho más fácil el diagnóstico de lesiones malignas y, por tanto, más fiable. Características citoplasmáticas útiles para un diagnóstico como, por ejemplo, delicado pigmento melánico, pueden encontrarse en extensiones e improntas cuando incluso no pueden identificarse en cortes por congelación o en secciones de parafina.

El diagnóstico de malignidad en los cortes de congelación se basa predominantemente en la presencia de un patrón infiltrativo de crecimiento. Sin embargo, lesiones inflamatorias también pueden presentar este patrón. Las muestras citológicas permiten establecer con confianza la condición benigna de los núcleos, estableciendo claramente la naturaleza de tales lesiones. Un ejemplo común de lesión infiltrativa de este tipo es la sarcoidosis cuyas características pueden observarse fácilmente en secciones de parafina pero, en cortes por congelación, pueden manifestarse sólo como grupos de células epitelioides, eosinófilas, en un ganglio linfático. En las preparaciones citológicas, tales células son fácilmente identificadas como histiocitos. De forma similar, las células que constituyen las glándulas y ductos de una adenocarcinoma pancreático asociado a una reacción desmoplásica, generalmente son claramente malignas, permitiendo su diferenciación de tejido glandular benigno atrapado en un tejido fibroso secundario a  un proceso inflamatorio.

Los extendidos citológicos rápidamente fijados y teñidos son casi de similar calidad que aquellos preparados con técnicas convencionales más lentas. Más aún, las preparaciones citológicas obtenidas de tejidos remitidos para estudios por congelación usualmente contienen muchas más células anómalas que las hechas por otros métodos.

SIMILITUD CON LA CITOLOGÍA ASPIRATIVA (Figs. 14,15)

La exactitud y fiabilidad, ausencia casi total de morbilidad grave y bajo coste de la citología aspirativa con aguja fina, es ampliamente reconocida. Sin embargo, ocasionalmente, hay patólogos que tienen poca experiencia en la interpretación de estos estudios y, a veces, son reacios a iniciar nuevos procedimientos diagnósticos con los que no se sienten cómodos.

Las muestras citológicas obtenidas de especímenes remitidos para estudios extemporáneos son esencialmente idénticas a las obtenidas por citología aspirativa. Tales preparaciones han sido incluso utilizadas en programas didácticos de citología aspirativa. Para los patólogos que están aprendiendo, las secciones por congelación proporcionan una correlación citohistológica inmediata  y, en las siguientes 24-48 horas, la correlación puede establecerse en las secciones permanentes.

DIFICULTAD DE SECCIÓN (Figs. 16,17)

Un problema persistente de los cortes por congelación es la dificultad de obtener secciones satisfactorias de ciertos tejidos como grasa, tejidos necróticos, calcificados y excesivamente blandos. Sin embargo, se pueden obtener extendidos diagnósticos de calidad excelente tanto de lesiones óseas como, incluso, de tejidos densamente calcificados.

Lesiones adiposas de órganos como la mama y epiplon, pueden dar extendidos diagnósticos que contienen un sorprendente número de células fácilmente identificables. También se pueden diagnosticar fácilmente mediante extensiones citológicas, nódulos metastásicos de epiplon y tejidos similares, aunque a menudo sean más fáciles de estudiar por congelación.

El tejido necrosado, especialmente los tumores necróticos, suele disgregarse si se seccionan y puede ser imposible obtener cortes por congelación. Sin embargo, los extendidos de tales especimenes, a menudo contienen células malignas claramente identificables. En estos casos, las preparaciones citológicas pueden ser el único modo de obtener un diagnóstico intraoperatorio.

BIOPSIA DE TAMAÑO PEQUEÑO (Figs. 24-30)

Las muestras citológicas de biopsias de pequeño tamaño, como en el caso de los tumores cerebrales, suelen ser más fáciles de interpretar que las secciones por congelación, ya que el detalle celular se mantiene más claramente. Si sólo se obtiene un pequeño fragmento de tejido y es posible realizar un diagnóstico con extendidos o improntas, es preferible con el fin de evitar la distorsión producida por la congelación.

RAPIDEZ

La rapidez del estudio citológico se ha citado como una de sus mayores ventajas. Las muestras citológicas pueden ser fácilmente examinadas en menos de dos minutos. Sin embargo, con equipos de congelación rápida, las secciones histológicas pueden estar listas en cuatro o seis minutos, dependiendo de las tinciones empleadas.

La rapidez con que se realizan los extendidos o improntas alcanza una mayor importancia cuando es necesario examinar más de una zona del espécimen, para el estudio de varias áreas de una biopsia aparentemente benigna, para el muestreo de varias zonas de un tumor necrótico, para el muestreo de varias áreas de un tumor grande que puede presentar focos pequeños con características de mayor grado, para el estudio de ganglios linfáticos (ganglio centinela (Figs. 6, 7), linfomas, metástasis, ….) o para el estudio de los bordes quirúrgicos de resección. La velocidad de las preparaciones citológicas no puede igualarse a las técnicas de secciones por congelación.

También es importante la rapidez con que se puede obtener un número determinado de extensiones o improntas de un mismo espécimen cuando se requieren estudios especiales (histoquímica, inmunocitoquímica, FISH,…), sin esperar las secciones en parafina.

DIAGNOSTICO DE INFECCIONES

La capacidad para diagnosticar lesiones infecciosas también ofrece ventajas. Si la identidad de una lesión con una apariencia macroscópica típica de granuloma, especialmente un granuloma necrotizante, puede ser confirmada citológicamente sin utilizar secciones por congelación, puede evitarse la contaminación del criostato, siendo innecesaria la posterior descongelación y esterilización.

 
Fig. 1 -

 
Fig. 2 -

 
Fig. 3 -

 
Fig. 4 - Impronta BAG de mama (intra-BAG) (Diff-Quik)

 
Fig. 5 -

 
Fig. 6 -

 
Fig. 7 - Detalle celular. Carcinioma tubular de mama. Papanicolaou rápoido (Pap-Quik).

 
Fig. 8 - Detalle celular. Tumor de células granulares de mama (Diff-Quik).

 
Fig. 9 - Detalle celular. Tumor de células granulares de mama (Diff-Quik).

 
Fi. 10 - Detalle citológico. Quiste de la hendidura branquial (Diff-quik y Papanicolaou).

 
Fig. 11 - Detalle citológico. Linfadenitis dermatopática. Células de Langerhans y pigmento melánico. Papanicolaou rápido (Pap-Quik).

 
Fig. 12 - Ganglio centinela. Infiltración por melanoma maligno.(Diff-Quik).

 
Fig. 13 - Ganglio centinela. Infiltración por carcinoma de mama. (Diff-Quik).

 
Fig. 14 - Similitud con la citología aspirativa. Sarcoma embrionario hepático. (Diff-Quik).

 
Fig. 15 - Similitud con la citología aspirativa. Tumor de células de Leydig. (Diff-Quik).

 
Fig. 16 - Dificultad de cortes en congelación (muestras blandas). Condrosarcoma mixoide extraesquelético. (Diff-Quik).

 
Fig. 17 - Dificultad de cortes en congelación (muestras blandas) y detalle de la matriz extracelular con métodos de Romanovsky. Paracordom.a (Diff-Quik).

 
Fig. 19 - "Fondo tigroide" (glucógeno) en la imagen de la izquierda (Diff-Quik). Detalle celular sin "fondo tigroide" (Papanicolaou). Sarcoma de Ewing/PNET.

 
Fig. 20 - Detalle celular. Tumor rabdoide extra-renal de partes blandas (Diff-Quik).

 
Fig. 21 - Detalle arquitectural y celular (Diff-Quik). Carcinoma neuroendocrino de bajo grado, tipo carcinoide gástrico.

 
Fig. 22 - Detalle celular. Tumor de células de la granulosa. Papanicolaou rápido (Pap-Quik).

 
Fig. 23 - Detalle celular. Carcinoma papilar de trompa uterina. Papanicolaou rápido (Pap-Quik).

 
Fig. 24 - Biopsia de tamaño pequeño. Astrocitoma de bajo grado (Hematoxilina-Eosina).

 
Fig. 25 - Biopsia de tamaño pequeño. Astrocitoma gemistocítico (Hematoxilina-Eosina).

 
Fig. 26 - Biopsia de tamaño pequeño. Astrocitoma anaplásico (Hematoxilina-Eosina).

 
Fig. 27 - Biopsia de tamaño pequeño. Glioblastoma (Hematoxilina-Eosina).

 
Fig. 28 - Biopsia de tamaño pequeño. Ependimoma (Hematoxilina-Eosina).

 
Fig. 29 - Biopsia de tamaño pequeño. Meningioma (Hematoxilina-Eosina).

 
Fig. 30 - Biopsia de tamaño pequeño. Meningioma (Hematoxilina-Eosina).

Bibliografía