10º Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica

Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica

ISBN: 978-84-692-76778

COMUNICACIONES

Nº 1797.

Método Inmunohistoquímico para detección de la proteína isoforma anormal del prion

Francisco Borja Gutierrez Corres^[1], Begoña Atarés Pueyo^[1], Maria Carmen Albaina Aberasturi^[1], Mª Angeles Hernandez Perez^[1], Mª Jesus Del Campo Murga^[1], Begoña Vergara Celaya^[1], Sorkunde Bergara Elorza^[1], Inocencia Moran Morgado^[1], Leire Cid Fernandez^[1], Josefina Marañon Calleja^[1]
(1) Hospital Txagorritxu ESPAÑA

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El agente patógeno de las encefalopatias espongiformes transmisibles (EET) es una partícula, denominada”Prion” por Prusiner, y está compuesta únicamente por la isoforma anormal (PrPsc) de una proteína celular normal o celular de la proteína del prion (PrPc), se expresa principalmente el sistema nervioso central, tejido linfático y uniones neuromusculares cono una proteína de membrana que se encuentra anclada mediante una cadena de glicolípidos. PrPsc deriva de PrpC mediante un proceso post-traduccional que involucra un cambio conformacional, que se manifiesta en un aumento del contenido en estructuras en laminas beta. Este cambio convierte a la Prpsc en susceptible de autoasociación, formando agregados estables y resistentes a la digestión por proteasas, que se depositan en el cerebro afectado.
La denomimación de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) se basa en dos de sus principales características: la espongiosis cerebral y la transmisibilidad.
Un concepto importante de la transmisión de las enfermedades prionicas lo constituye la barrera ínterespecie, que se manifiesta en una reducción de la infectividad y un aumento en tiempo de incubación cuándo la transmisión se da entre animales de distinta especie, esto depende esencialmente de las diferentes estructuras de PrP del inoculo y el huésped. Importante destacar rasgos genéticos de como el polimorfismo del codón 129 en la PRNP humana puede modificar la susceptibilidad a la infección prionica.

Introducción

Encefalopatías espongiformes en humanos:

Kuru:

· Tribu Fore Guinea-Papua. Relacionado con el canibalismo.

· Clínica: Ataxia, demencia.

· A.P: Placas tipo Kuru.

Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ):

· Mas frecuente.

· Tipos:

· Esporádico (ECJe):

- Clínica: Demencia, piramidalismo, mioclonias y EEG peculiar.

- A.P: espongiosis en sustancias gris cortical y subcortical.

· Iatrogénico o adquirido:

- Contagios en transplantes de cornea, procedimientos neuroquirurgicos, terapia hormonal (hipófisis de cadáveres infectados)

- Clínica: Demencia, piramidalismo, mioclonias y EEG peculiar.

- A.P.: espongiosis en sustancias gris cortical y subcortical.

· Familiar (ECJf):

- Herencia autonómica dominante.

- Clínica: demencias, ataxia, mioclonias.

- A.P.: espongiosis en sustancias gris cortical y subcortical.

· Variante ( ECJv):

- Enfermedad nueva, manifestación humana de la encefalopatía espongiforme bovina.

- Clínica: Alteración conductual, demencia, parestesias.

- A.P.: espongiosis difusas, placas floridas.

Síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker (SGSS):

· Mutación en la PRNP codón 112 y alteraciones en los codones 105, 145 y 117.

· Clínica: Ataxia y demencia.

· A.P.: Espongiosis y placas multicentricas.

Insomnio Familiar Letal (IFL):

· Mutación en la PRNP codón 178.

· Clínica: Insomnio, ataxia y demencia.

· A.P.: Gliosis talámica y en olivas inferiores.

Material y Métodos

Material:

-Olla a presión.

-Hornillo.

-Ácido Clorhídrico al 32%.

-Proteasa k Dako 40x.

-Agua Destilada.

-Ácido fórmico 95-100%.

-Cubetas Coplín.

-Proteína Prión monoclonal mouse anti-prión protein clone 3f4 ref. M7216.

-Kit de inmunotinción Dako Envision flex.

Método:

-Después de que el encéfalo lleva fijado el formol 10% un mes, se procede al tallado.

-Tallado:Personal encargado de realizar el tallado. Modo:

-Colocar el encéfalo sobre empapadores.

-Cortes no tienen que tener un grosor superior a 5 mm.

-Introduce los casettes con el tejido en ácido fórmico concentrado (95-100%) durante 1 hora, bajo la campana extractora.

-Después en solución reciente 1:10 de formol tamponado 48 h.

-Procesamiento de los tejidos en el procesador automático de forma habitual.

-Corte en micrótomo Minot 4 m .

-Se introducen los cortes en una estufa 35ºc durante toda la noche.

-Desparafinar e hidratar.

-Desenmascaramiento antigénico por por calor con olla a presión. Utilizaremos como liquido de desenmascaramiento el ácido clorhídrico 2 mM. 2 litros de agua destilada + 388 ml de HCL al 32%.

Calentar en la olla a presión 2 L de la solución recuperadora hasta la ebullición. Cubrir, pero no sujetar la tapa. Colocar los portaobjetos en los bastidores metálicos de tinción e introducirlos en la olla a presión. Asegurarse de que los portaobjetos quedan completamente sumergidos en la solución recuperadora. Cerrar la tapa. Cuando la olla a presión alcanza la temperatura y presión de funcionamiento, cronometrar 3 minutos. Sacar la olla a presión de la fuente de calor y enfriarla. Abrir la tapa y dejar oreando durante 20 minutos.

-Lavar con H2O destilada.

-Digestión con la enzima Proteasa k durante 5 min.

-Varios lavados con H2O destilada.

-Sumergir los portas en Ácido fórmico 98-100% durante 5 min.

-Lavar con Buffer de lavado (Envision Flex Wash buffer 20X). 5 min.

-Inmuno-tinción con teñidor automático Autostainer PlusLink Dako.

-Buffer de lavado.

-Bloqueo de la peroxidasa endógena 5 min.

-Buffer de lavado.

-Incubación con anticuerpo primario Anti-Prion Proteína 1:30 durante 30 min.

-Buffer de lavado.

-Incubación con polímetro HRP ref. k8000, k 8002, k80023.

-Buffer de lavado.

-Sustrato + cromógeno DAB 10 min.

-Buffer de lavado

-Contraste con hematoxilina de Mayer.

-Azuleamiento con buffer de lavado.

-H2O destilada.

-Deshidratar, aclarar y montar DPX.

Resultados

- Corte macroscopico de cerebro

- Hematoxilina/ eosina

- Inmunohistoquimica de la proteína isoforma anormal del prion

Conclusiones

-Formol es el responsable del enmascaramiento antigénico ya que la formación de puentes cruzados transforma u oculta los antigeno/epitopos, en esta técnica dado a su elevada permanencia en formol realizamos la recuperación antigénica por medio de calor con ácido clorhídrico al 2 mmol/L.

-Utilizaremos la proteasa K para eliminar la PrPc, mientras que PrPsc es resistente a la digestión. Si en tiempo de permanencia se excede puede digerí al antígeno y producir desprendimiento del tejido.

- La utilización del ácido fórmico 98-100% después de realizar la recuperación antigénica, es para evitar la patogenidad del prión.

-Se deben emplear cristales pretratados para evitar que se desprenda el tejido.

-Para obtener resultados en la tinción es importante tener en cuenta dos factores el PH y la molaridad

Agradecimientos

Agadecemos la colaboración de Raquel Lopez Gutiérrez por el soporte informatico y administrativo.

Bibliografía

1 -Laboratorio de anatomía patológica. Raimundo García del Moral. Editorial Interamericana McGraw-Hill.

2 -Dorland diccionario enciclopédico ilustrado de medicina. 20 ediciones. Editorial Interamericana McGraw-Hill.

3 -Exámenes de laboratorio, técnicas microscópicas. C. Nezelof, P. Galle, N. Hinglais. Editorial Jims.

4 -Instituto de patología de las fuerzas armadas de los estados unidos de América (AFIP), Métodos Histotecniologicos.

Washington D.C. 1995.

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