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Detección de DNA
Es la más extendida y en ella se basan por el momento los programas de detección de VPH en distintas muestras. Existen dos técnicas que son las más conocidas: La captura de híbridos de segunda generación (HC-2) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Existe un tercer método que es la hibridación in situ sobre muestras citológicas o histológicas pero está menos extendida.
CAPTURA DE HIBRIDOS DE SEGUNDA GENERACION (HC-2):
Se trata de una hibridación in situ que se realiza en medio líquido. La reacción detecta el RNA derivado de los VPH, cuando lo enfrentamos con DNA complementario. Existen dos Kits diferentes, uno para virus de alto riesgo y un segundo kit para virus de bajo riesgo. El más frecuentemente utilizado es el primero. Su validez depende de la cantidad de muestra analizada, de forma que con cantidades inferiores a las necesarias, el resultado es de “muestra insuficiente”.
Una vez producida la reacción se procede a su lectura mediante quimioluminiscencia de forma que da una idea de la cantidad de virus que contiene una muestra (Carga viral), pero esta idea no es muy precisa.
La positividad se cifra en 1 pg, pero algunos grupos informan de reacción positiva cuando se detectan 0.85 pg y otros informan de reacción positiva cuando se detectan 2 pg.
Cuando el análisis se efectúa en muestras de citología liquida, se recomienda repetir la muestra cuando el resultado obtenido se cifra entre 2.5 y 0.8 pg de forma que a veces es necesario repetir la prueba tres veces. En la Literatura este grupo de resultados se registran como “borderline” y por si mismos tienen poco significado. Debe tenerse en cuenta que este método no detecta la presencia de VPH en aproximadamente un 4-5% de HSIL, y que es posible que en este grupo, exista metilación de E2 o bien los virus estén integrados, pero deberían reportarse como falsos negativos. Además es conocido que las cargas virales son superiores en muestras provenientes de casos de ASCUS y LSIL que en muestras provenientes de casos de HSIL. Así pues las cargas virales “borderline” deben valorarse en el contexto del resultado de la citología, no teniendo valor alguno si se trata de un HSIL, y relativamente poco valor si el resultado de la citología es negativo, ASCUS o LSIL.
Por otro lado El método puede presentar falsos positivos cuando se utiliza el kit para virus de alto riesgo. En la Literatura se reporta aproximadamente un 10-15% de casos de reacciones cruzadas con virus de bajo riesgo.
Su gran ventaja es la sensibilidad y es también muy específico, pero su mayor valor radica en el valor predictivo negativo, de forma que una paciente con una citología negativa y una determinación de VPH negativa, tiene unas probabilidades prácticamente nulas de tener alguna lesión en aquel momento. Este detalle puede utilizarse para elaborar programas de screening combinados e incluso para efectuar controles de calidad de la citología. A la inversa el valor predictivo positivo de la prueba es bajo. En el estudio ALTS se registra que la determinación de VPH por HC-2 tiene un valor predictivo positivo para CIN-III del 10% y para CIN-II del 19.6%. En este sentido, cuando se obtiene un resultado positivo en una muestra, lo que se está detectando es un riesgo de tener lesión, pero no necesariamente que la paciente deba tener una lesión en aquel momento.
El método solamente puede aplicarse en muestras obtenidas específicamente para este fin o en citología liquida. No es aplicable a otras muestras como orina, o muestras de ano, por la limitación del material obtenido. Tampoco puede aplicarse sobre muestras de tejido.
El método está aprobado por la FDA.
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Esta técnica se basa en la obtención en el Laboratorio de un número considerable de cadenas de DNA de la muestra a analizar, mediante amplificación del DNA contenido dicha muestra. Por tanto no es una prueba que tenga limitaciones debidas a la cantidad del material obtenido. Una vez realizada la amplificación se enfrenta el DNA problema, con un DNA de secuencia conocida. Para ello, se utilizan los llamados “primers de consenso”, MYO 9/11 o GP5+/GP6+, que se diferencian por la cantidad de pares de bases que contienen, mayor en los “primers” MYO 9/11. Estos "primers" de consenso detectan las regiones “L” de los HPV.
La positividad o negatividad de la reacción se obtiene corriendo la muestra en un gel de agarosa, y detectando los productos obtenidos en base a su peso molecular.
Debe realizarse una primera PCR para determinar la presencia o ausencia de HPV. Si se detecta su presencia, debe realizarse una segunda prueba para identificar el tipo de virus del que se trata (Genotipar). Ello puede hacerse mediante enzimas de restricción, mediante secuenciación o bien mediante PCR en tiempo real.
Puede usarse también la PCR para detectar las regiones E, concretamente E2 y E6 y estos se utilizan para detectar integración.
La sensibilidad es prácticamente la misma que la de la captura de híbridos y su especificidad también, pudiendo perderse algo de especificidad en la manipulación de la muestra.
La PCR puede hacerse sobre cualquier muestra, citológica o histológica incluida en parafina o congelada, e incluso en muestras de orina y ano.
No está aprobada por la FDA e incluso de recomienda que no se utilice para diagnóstico.
HIBRIDACION IN SITU
Es un método que enfrenta el DNA problema contenido en una muestra, citológica o histológica, extendida en un portaobjetos, con un DNA conocido que permita identificar la presencia de virus de alto o de bajo riesgo.
Es muy específico pero poco sensible.
Permite obtener dos tipos de patrón de reactividad nuclear, un patrón punteado y un patrón difuso. Los datos de la Literatura apuntan hacia que el patrón punteado correspondería a integración del virus en el genoma celular mientras que el patrón difuso correspondería a la presencia de virus episomal.
INDICACIONES CLINICAS DE LA DETECCION DE HPV:
a) Screening poblacional.
b) Clínica.
a) Screening poblacional: El método debe ser lo más sensible posible dado que interesa “perder” la menor cantidad de pacientes susceptibles de tener lesión. Ambas, la PCR y la HC-2 pueden usarse ya que tienen un valor predictivo muy alto, similar en ambas. Se discute si debe utilizarse como screening primario o este debe ser la citología. Probablemente las estrategias deben ser distintas según la población sobre la que deba actuarse, y probablemente los métodos de screening deben ser combinados y adaptados al tipo de población sobre el que se actúe. De todas formas, en screening poblacional, lo más importante es poder llegar al máximo número de mujeres posible.
b) En la clínica: La detección de HPV por el momento está indicada en los siguientes casos: 1) ASCUS, dado que según el estudio ALTS, en estos casos se detectaría HPV en algo menos de un 50% de casos, lo que permitiría subclasificar las pacientes en dos grupos, uno (HPV+), con riesgo de tener lesión, y otro (HPV -), sin este riesgo. En este sentido, si se utiliza HC-2, deben tenerse en cuenta las reacciones cruzadas descritas anteriormente, que quizá son distintas en casos de ASCUS (Hay poca información en la Literatura) y que por tanto quizá algunas de las pacientes identificadas como de riesgo no estarían en realidad en este grupo. Sin embargo las pacientes identificadas como no de riesgo, en realidad no lo tendrían, dado el alto valor predictivo negativo de la prueba. En cualquier caso, estos estudios podrían realizarse también con PCR, con las mismas garantías y sin reacciones cruzadas. 2) CONTROL POST CONIZACION: Está bien establecido que en los controles post-conización es importante la detección de VPH, ya que es un factor pronostico respecto a la recidiva, independientemente de si persiste la infección desde la conización o si se ha producido reinfección en el periodo postoperatorio. En realidad el valor predictivo negativo para la recidiva es la negatividad de los márgenes de resección en la pieza, sumada a la negatividad de la citología de control y a la negatividad de la determinación de HPV. De estos tres datos el menos importante es la negatividad de los márgenes de resección de la conización y el más importante es la combinación de las negatividades de la citología y la detección de HPV. 3) LSIL: La determinación de HPV en las lesiones de bajo grado carecen “per se” de importancia ya que en el Estudio ALTS se demostró que aproximadamente un 85% de estos casos muestran positividad para HPV de alto riesgo y que por tanto esta prueba no discriminaría en dos grupos de pacientes como lo hace en el caso de ASCUS y en consecuencia no determinaría actitudes clínicas distintas. Está en discusión si la carga viral puede ser un factor pronóstico en LSIL, así como otras pruebas que se han llamado en este escrito como “alteraciones derivadas de la infección por VPH”.
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PONENCIAS