Microscopía Confocal de Exploración Láser para el estudio de Biofilms en tejidos de la vía aérea superior

Natalia Angel Villegas^[1], Julio E Arce Miranda^[1], Roque Romero Díaz^[2], Mario Zernotti^[2], Magdalena Roques Revol^[2], Sebastián Picciafuoco^[2], Marina Botiglieri^[3], Marisa E. Paredes^[4], M. Gabriela Paraje^[1]
(1) Dto de Farmacia, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba. Argentina. ARGENTINA
(2) Servicio de Otorrinolaringología de la Clínica Reina Fabiola, Fundación para el progreso de la Universidad Católica de Córdoba. Argentina. ARGENTINA
(3) Dto de Bacteriología de la Clínica Reina Fabiola -Fundación para el progreso de la Universidad Católica de Córdoba. ARGENTINA
(4) Dto de Bacteriología. Sanatorio Allende. Av. Hipólito Irigoyen 384, 5000 Córdoba, Argentina. ARGENTINA

Resumen

INTRODUCCIÓN:
Los biofilms representan una comunidad de células sésiles que crecen unidas irreversiblemente a una superficie sólida, viva o inerte; embebidas en una matriz extracelular producida por ellas mismas, exhibiendo un fenotipo alterado con respecto al índice de crecimiento y transcripción de genes.
Actualmente los biofilms son considerados factores de virulencia, puesto que constituyen un modo de crecimiento protegido, lo cual permite la supervivencia en un medio hostil, facilitando la unión de las bacterias a distintas  superficies, ayudando al mantenimiento de las colonias y protegiéndolas de distintos factores, como los cambios en las condiciones ambientales, la posibilidad de ser fagocitadas por células macrofágicas del huésped, depredadas por otros protozoos o por el efecto de los agentes antimicrobianos.
La Microscopia Confocal de Exploración Láser (MCEL) permite el estudio no destructivo del biofilms, haciendo un barrido del mismo en todo su espesor,  posibilitando la obtención de planos a distintas profundidades con los cuales es posible reconstruir su estructura tridimensional.

OBJETIVO:
Los objetivos de este trabajo fueron utilizar MCEL para el estudio de biofilms microbianos en tejidos de la vía aérea superior, determinando la calidad y cantidad de biofilms presentes. También, aislar los distintos géneros bacterianos formadores de los mismos y estudiar la capacidad de formar biofilms “in vitro”.

MATERIALES Y MÉTODOS:
Se estudiaron adenoides y amígdalas de pacientes pediátricos y pólipos nasales de pacientes adultos, ambos grupos sometidos a cirugía. Los protocolos se encuentran aprobados por los comités de ética de las Instituciones intervinientes, con el correspondiente consentimiento firmado de los responsables de donar el material para este estudio.
Los biofilms fueron observados mediante MCEL utilizando como colorantes una solución de yoduro de propidio (15μM) durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las  células bacterianas se tiñeron de rojo, seguida de una solución de 50 microgramos/ ml de concanavalina A (Con A) isotiocianato de fluoresceína (FITC), al mismo tiempo y temperatura que el colorante anterior, para detectar la matriz de glucocáliz en color verde. Las cepas fueron aisladas de los tejidos por técnicas microbiológicas clásicas.
La capacidad de formar biofilms “in vitro” se midió mediante la adhesión a placas de 96 pocillos y su posterior tinción con Cristal Violeta y elusión con alcohol/acetona, determinando la densidad óptica a 595nm (DO595nm).

RESULTADOS:
Por MCEL, en los tejidos de los pacientes estudiados, se observaron tanto microcolonias como macrocolonias bacterianas formando biofilms, algunas de ellas como estructuras bacterianas mixtas; siendo Staphylococcus aureus, Streptococcus viridans, Haemophylus influenzae, y Staphylococcus coagulasa negativo, los principales microorganismos formadores de biofilms. Existen muy pocos antecedentes de la presencia de biofilms en pólipos nasales. En ensayos “in vitro” de las especies aisladas se observaron valores de DO595nm desde 0,173 hasta 4,764 cuando se colorearon con Cristal Violeta.

DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES:
MCEL ha demostrado ser una herramienta de gran utilidad al momento de analizar la estructura tanto de la matriz exopolisacárida extracelular, como de las células que conforman los biofilms inmersos en tejidos de la vía aérea superior. Con las cepas aisladas se pudo corroborar esta capacidad de formar biofilms “in vitro”.
Estos cuadros clínicos de la vía aérea superior, pueden tener relación directa con la presencia de microorganismos en forma de biofilms. Demostrar la presencia de los mismos, ayuda a confirmar la hipótesis de que las  bacterias, protegidas de las defensas del huésped, en forma de biofilms, continúan con su metabolismo y la producción de exotoxinas locales, lo que favorecería la cronicidad de la respuesta inflamatoria evidenciable por los cambios en la mucosa respiratoria y la persistencia de infecciones que no responden a los tratamientos antibióticos.

Introducción y Objetivo    

INTRODUCCIÓN

El biofilms representa una comunidad de microorganismos derivados de células sésiles que crecen unidas irreversiblemente a una superficie sólida, viva o inerte, embebidas en una matriz extracelular producida por ellas mismas, exhibiendo un fenotipo alterado con respecto al índice de crecimiento y transcripción de genes. Aunque la composición del biofilms es variable, en general, el componente mayoritario es el agua, pudiendo representar el 97% del contenido total. La masa de éstas estructuras está formada aproximadamente por un 15% de células y el resto formada principalmente por exopolisacáridos secretados por las propias células que forman parte del mismo, pudiendo contener también, en menor cantidad, proteínas, DNA y productos diversos procedentes de lisis bacteriana. La matriz no es sólida y presenta canales que permiten el flujo de agua, nutrientes y oxígeno incluso hasta en las zonas más profundas, sin embargo, en su interior pueden existir diferentes concentraciones de los mismos, aumentando la heterogeneidad sobre el estado fisiológico en el que se encuentra la bacteria dentro del biofilms. En esa comunidad heterogénea, dinámica y de estructura compleja los microorganismos conviven y poseen un sistema de señales, que dirigen el fenotipo y regulan la expresión de genes que no siempre se expresan en las formas planctónicas o de vida libre. La capacidad de formación de biofilms no parece estar restringida a un grupo específico de  microorganismos y se considera que bajo condiciones ambientales adecuadas todos son capaces de formar biofilms, pudiendo estar constituidos por una o más especies bacterianas (Costerton y col, 2003, Flemming, 2007).

Actualmente se considera al biofilms como un factor de virulencia, puesto que constituye un modo de crecimiento protegido que permite la supervivencia en un medio hostil, facilitando la unión de las bacterias a distintas superficies, ayudando al mantenimiento de las colonias y protegiéndolas de distintos factores, como los cambios en las condiciones ambientales, la posibilidad de ser fagocitadas por células del huésped, depredadas por otros protozoos o por el efecto de los agentes antimicrobianos. Los biofilms están implicados en infecciones crónicas, lentas, resistentes a los tratamientos, asociadas a la adhesión a tejidos naturales, como en las infecciones otorrinolaringológicas, donde  Pseudomonas aeruginosa, Haemophylus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Staphylococcus aureus son los microorganismos más frecuentemente asociados. La formación de biofilms bacterianos provoca en el huésped la aparición de una respuesta inmune. Células como leucocitos polimorfonucleares, monocitos y macrófagos inducen una respuesta celular, con alteraciones morfológicas, liberación de especies reactivas del oxígeno y del nitrógeno, de enzimas lisosomales, etc. Esto frecuentemente contribuye a la cronicidad de la infección por el daño causado en el tejido circundante favoreciendo el crecimiento del biofilms. Cuatro criterios se han propuesto para calificar a un biofilms como agente etiológico: I) la bacteria patógena se encuentra asociada a una superficie o adherida a un sustrato; II) el examen directo muestra las bacterias en cúmulos, incrustadas en una matriz propia o formada por componentes del huésped; III) la infección es localizada, y IV) la infección puede ser resistente a los antibióticos (ATB) pese a la sensibilidad de las formas planctónicas. (Palmer, 2005; Post y col 2004; Sanclement y col 2002; Vuong y col, 2004).

Otra característica que distingue las infecciones crónicas relacionadas con biofilms de las infecciones agudas, es su respuesta a tratamientos ATB. Varias razones han sido investigadas, aunque el mecanismo preciso de cómo se altera esta sensibilidad no está esclarecido. Aunque no sería el principal mecanismo de resistencia asociada a biofilms, se postula que los ATB podrían penetrar la estructura, pero no alcanzarían una concentración efectiva en algunos sitios del mismo por las características físicas y/o químicas de la matriz. La depleción de nutrientes y oxígeno dentro del biofilms podría ser la causa de que las bacterias se encuentren en un estado de latencia presentando resistencia a ATB comparado con las células planctónicas. También se ha descripto la existencia de microambientes que antagonizan la acción del ATB y mecanismos de degradación activa en algunas partes del biofilms. Debido a la naturaleza heterogénea del biofilms, es probable que existan múltiples mecanismos de resistencia microbiana comparado con las células planctónicas (Stoodley and Costerton, 2002).

Una causa de resistencia a los ATB y a las defensas del huésped podría ser la presencia de biofilms en las criptas amigdalinas de pacientes con amigdalitis crónicas. Chole y col. (2002; 2003) han demostrado la presencia de biofilms en piezas quirúrgicas de amígdalas de niños, en quienes la cirugía fue indicada tanto por infecciones recurrentes como por patología obstructiva (hipertrofia), y afirman que las bacterias se encuentran protegidas de las defensas del huésped gracias al biofilms, continuando con su metabolismo y la producción de exotoxinas locales, lo que favorecería la cronicidad de la respuesta inflamatoria.

A pesar del grado de conocimiento alcanzado en los últimos años, algunos aspectos importantes sobre biofilms continúan sin ser esclarecidos.  En el laboratorio de Higiene y Microbiología de la FCQ-UNC estamos estudiando los mecanismos utilizados por algunos microorganismos para formar y mantener estas comunidades multicelulares, así como la influencia que tienen los biofilms en el proceso infeccioso.

OBJETIVO

Los objetivos de este trabajo fueron utilizar MCEL para el estudio de biofilms microbianos en tejidos de la vía aérea superior, determinando la calidad y cantidad de biofilms presentes. También, aislar los distintos géneros bacterianos formadores de los mismos y estudiar la capacidad de formar biofilms “in vitro”.

Material y Métodos    

Muestra poblacional

En el presente trabajo se incluyeron dos tipos de pacientes. Un grupo de 12 pacientes (entre 36 meses y 6 años de edad) que presentaron antecedentes de cuadros infecciosos recurrentes u obstrucción de la vía aérea superior a los cuales se les practicó cirugía de amígdalas o adenoides y otro grupo de ocho pacientes adultos, de ambos sexos, sometidos a cirugía por presencia de pólipos nasales. Los  protocolos se encuentran aprobados por los comités de ética de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Nacional de Córdoba y de las dos Instituciones Hospitalarias participantes, con el correspondiente consentimiento firmado de los responsables de donar el material para este estudio.

Procesamiento de la muestra

Los tejidos obtenidos de las cirugías, se extirparon según técnicas convencionales, sin comprometer su integridad anatómica y luego se cortaron en rodajas perpendiculares a su diámetro longitudinal las cuales fueron colocadas, con su debida identificación, en formol 10%.

Para el montaje de las mismas se realizó un lavado con agua corriente para retirar el exceso de formol y se efectuaron deshidrataciones en alcohol 96º y alcohol 100º en estufa a 60ºC durante una hora, respectivamente, colocando otra hora, las muestras en xilol. Se pusieron en un molde de parafina, donde se dejaron solidificar y luego se realizaron cortes de 2 a 4 micrómetros de espesor con micrótomo. Posteriormente, se distribuyeron en portaobjetos, dejando en estufa a 60ºC para su fijación.

Antes de realizar las coloraciones para la observación microscópica, se procedió a desparafinar el material por inmersiones en xilol, dos veces durante 15 min; cinco inmersiones en alcohol 100º y 96º respectivamente, lavado con agua destilada y secado  a temperatura ambiente.

Estudio de la presencia de biofilms microbianos mediante Microscopia Confocal de Exploración Láser

Las muestras fueron enjuagadas durante 10 minutos con Buffer Fosfato Salino (PBS) estéril 50mM y posteriormente los biofilms fueron observados mediante MCEL utilizando como colorantes una solución de yoduro de propidio (15μM) durante 5 minutos a temperatura ambiente para detectar las células bacterianas en rojo. A continuación, se realizó un lavado con PBS y luego las muestras fueron expuestas a una solución de 50 microgramos/ml de concanavalina A (Con A) isotiocianato de fluoresceína (FITC), al mismo tiempo y temperatura que el colorante anterior, para detectar la matriz de glucocáliz en color verde. El yoduro de propidio fue exitado a 520 nm y las emisiones fueron monitoreadas a 620 nm mientras que el FICT fue exitado a 495 nm y monitoreado a 525 nm. (Psaltis y col, 2007).

Los biofilms fueron examinados de manera no destructiva utilizando un MCEL  (Olympus Fluoview Espectral FV1000) equipado con una lente de inmersión 100X/1.40 (Olympus UPlanSApo UIS2). Se recogieron secciones ópticas de 0,87 micras del espesor total del biofilms y posteriormente las imágenes de tres posiciones elegidas al azar fueron obtenidas y analizadas. Para el análisis de la imagen, tres investigadores (JAM, NAV y MGP) evaluaron de forma independiente a simple ciego las imágenes de una manera retrospectiva.

Cuantificación “in vitro” de la formación de biofilms  

La capacidad de formar biofilms “in vitro” se midió mediante la adhesión a placas de 96 pocillos utilizando el método de  O`Toole y Kolter (1998) basado en la capacidad de las bacterias de formar biofilms sobre superficies sólidas y su  posterior tinción con Cristal Violeta y elusión con alcohol/acetona (70:30), determinando la densidad óptica a 595nm. (Deighton y col,2001)

Para llevar a cabo el estudio se realizó un cultivo over-night de cada especie bacteriana correspondiente a una DO_{595 nm} = 0,8 medida en espectrofotómetro (UV-1601 PC visible Shimadzu). Luego se realizó una dilución 1/100 del cultivo over-night en caldo tripetína-soya, la cual fue sembrada por triplicado en una placa de polipropileno de 96 pocillos y se incubó en estufa a 37 ºC sin agitación durante 24 hs. Transcurrido el período de incubación, se retiró el sobrenadante y se enjuagó la placa tres veces con PBS pH 7,2. Posteriormente se dejó secar la placa a temperatura ambiente durante 24 hs y se realizó la coloración utilizando 200µl de cristal violeta 1% durante 3 min. Se lavó la placa hasta retirar la totalidad del colorante que quedo sin adherirse al biofilms y se colocó una solución de alcohol/acetona para determinar la absorbancia del colorante a 595 nm con un elisómetro (BioRad) (Bendouah y col, 206).

Resultados    

Se estudió la presencia de biofilms en 20 pacientes por MCEL. La demostración específica de la formación de biofilms fue por MCEL basada en la reconstrucción tridimensional del mismo y el empleo de dos marcadores fluorescentes.

En los pacientes con pólipos nasales se observaron las bacterias unidas irreversiblemente en la superficie del tejido de la vía aérea superior, en forma de racimos como microcolonias y/o macrocolonias con matriz extracelular a su alrededor. Algunas estructuras bacterianas estuvieron presentes en las invaginaciones del tejido pero la mayoría estuvo adherida a la superficie (Figura 1).

En la Figura 2 se observa un biofilm de tejido adenoideo, donde, de color rojo, por tinción con yoduro de propidio, se ven las células bacterianas principalmente en la base del biofilm y en verde la matriz extracelular (glucocálix) por coloración con FITC.

Los microorganismos formadores de biofilms que pudieron ser aislados fueron: Staphylococcus aureus en cuatro pacientes; Streptococcus viridians, en tres; Staphylococcus coagulasa negativa y Haemophylus influenzae, en dos pacientes; Pseudomonas aeruginosa y Enterococcus faecalis, en un paciente.

También se encontraron biofilms mixtos, formados por los complejos: Streptococcus viridians-Corinebacterium, Streptococcus viridians–Haemophylus influenzae, Haemophylus influenzae–S.pneumoniae, Haemophylus influenzae–S. pyogenes, Haemophylus influenzae–S. coagulasa negativa, Haemophylus influenzae– Staphylococcus aureus, este último en dos pacientes.

Con las cepas aisladas se cuantificó la capacidad de formar biofilms in vitro por microtécnica en placas de polipropileno, coloración con cristal violeta y lectura de la DO_595nm. La interpretación de resultados se realizó según la Tabla 1.

            El 83% de las cepas fueron formadoras de biofilms (Positivo), con valores de DO_595nm desde 0,173 hasta 4,764. Dos cepas se clasificaron como Positivas/Intermedias por estar cercanas al punto de corte utilizado. Los pacientes 1 a 8 corresponden a pacientes con pólipos nasales  y de 9 a 20 a pacientes pediátricos, Tabla 2.

En la figura 3 se muestra una comparación de distintas microscopías (ópticas, de fluorescencia y MCEL) utilizadas para el estudio de biofilms bacterianos presentes en tejidos de la vía aérea superior. La microscopía óptica es una técnica simple, accesible y económica en cuanto a reactivos y microscopio, los cuales están presentes en todos los laboratorios de microbiología, pero presenta dificultad para observar sobre todo las microcolonias del biofilms. Le sigue la microscopía de fluorescencia, donde es más fácil la localización de los biofilms, pero se elevan los costos para su estudio. La MCEL es la técnica estándar de oro para el estudio de biofilms, la combinación de colorantes fluorescentes permite el estudio diferencial de las células sésiles y de la matriz exopolisacárida que conforman el biofilm y permite estudiar diferentes cortes posibilitando la reconstrucción tridimensional del mismo. Sin embargo, el elevado costo, la hace, muchas veces inaccesible para la clínica.

TABLA 1 Escala para la cuantificación por microtécnica
DO595nm >0.24	Positivo	Formadora de biofilms
DO595nm >0.12 y <0.24	Intermedio	Débilmente formadora de biofilms
DO595nm <0.12	Negativo	No forma biofilms

TABLA 2 Cuantificación por espectrofotometría UV
Paciente No.	Género y especie aislado	O.D.590nm± DS
	Streptococcus viridians	3,337 ±0,029	Positivo
	Staphylococcus aureus	1,237 ±0,014	Positivo
	Staphylococcus aureus	0,332 ±0,003	Positivo
	Pseudomonas aeruginosa	0,956 ±0,062	Positivo
	Streptococcus viridians-Corinebacterium	0,312 ±0,019	Positivo
	Staphylococcus coagulasa negativa	0,316 ±0,019	Positivo
	Staphylococcus aureus	0,428±0,012	Positivo
	Enterococcus faecalis	0,428±0,017	Positivo
	Staphylococcus aureus	1,552±0,055	Positivo
	Staphylococcus coagulasa negativa	1,825±0,124	Positivo
	Streptococcus viridians	0,872±0,146	Positivo
	Streptococcus viridians – H. influenza	0,503±0,165	Positivo
	Streptococcus viridians	0,173±0,038	Intermedio
	Haemophylus influenzae – S. pneumoniae	0,248±0,001	Positivo/ Intermedio
	Haemophylus influenzae	0,912±0,356	Positivo
	Haemophylus influenzae	4,764±0,453	Positivo
	Haemophylus influenzae – S. pyogenes	0,248±0,043	Positivo/ Intermedio
	Haemophylus influenzae – S. coagulasa negativa	4,600±0,388	Positivo
	Haemophylus influenzae – Staphylococcus aureus	1,053±0,085	Positivo
	Haemophylus influenzae – Staphylococcus aureus	0,785±0,001	Positivo

Figura 1. Biofilms presentes en la superficie y en invaginaciones de pólipos nasales. A y C: coloreados por tinción de Gram y observación con microscopía óptica. B y C: matiz extracelular del biofilms coloreada con FITC y ConA y observada con MCEL. El biofilms se observa como macrocolonias con bacterias densamente empaquetadas. (X 100).

Figura 2. Secuencia de fotos del biofilms en las superficie de una amígdala observadas por MCEL. Desde la superficie del biofilms (A) a la base del mismo (F). “c” células sésiles del biofilm teñidas de rojo por el yoduro de propidio; “g” glicocalix coloreado de verde por FICT y ConA.

Figura 3. Comparación de distintas microscopías utilizadas para el estudio de biofilms bacterianos presentes en tejidos de la vía aérea superior. A, B y C) Microscopía óptica. D, E y F) Microscopía de fluorescencia. G, H e I) biofilms observado por MCEL.

Discusión    

En la última década, se ha estudiado que el 99 % de las bacterias existen en la naturaleza agrupadas como biofilms. Investigaciones recientes describen que  al menos  65 % de todas las infecciones humanas de amígdalas son causadas por biofilms bacterianos (Potera, 1999).

Además, existe un porcentaje cada vez mayor de pacientes con cuadros clínicos recurrentes de vía aérea superior con episodios de rinitis, otitis y otras manifestaciones clínicas como hipertrofia del tejido linfoide. Estos cuadros clínicos pueden tener relación directa con la presencia de bacterias en forma de biofilms. Demostrar la presencia de los mismos en tejido de la vía aérea superior en piezas quirúrgicas de pacientes en quienes la cirugía fue indicada tanto por infecciones recurrentes como por patología obstructiva (hipertrofia), ayudaría a confirmar la hipótesis de que las bacterias, protegidas de las defensas del huésped, en forma de biofilms, continúan con su metabolismo y la producción de exotoxinas locales, lo que favorecería la cronicidad de la respuesta inflamatoria evidenciable por los cambios en la mucosa respiratoria. (Mladina y col 2008; Vlastarakos y col 2007).

MCEL ha demostrado ser una herramienta de gran utilidad al momento de analizar la estructura tanto de la matriz exopolisacárida extracelular, como de las células que conforman los biofilms inmersos en tejidos de la vía aérea superior. Con las cepas aisladas se pudo corroborar la capacidad de las mismas de formar biofilm “in vitro”.

Conclusiones    

El estudio de la presencia, la capacidad de formar biofilms “in vitro” y los distintos géneros bacterianos que los forman, aportan evidencias claves para entender la infección y colonización microbiana en la vía aérea superior y la resistencia que muchas veces presentan a ATB de uso clínico.

Agradecimientos    

Natalia Angel Villegas es becaria doctoral de CONICET y Julio Arce Miranda es becario doctoral de FONCyT. María Gabriela Paraje es miembro de la carrera de Investigador de CONICET. Los autores agradecen a los Dres. Carlos Mas, María Cecilia Sampedro y a la Bioq. Paula Icely por su excelente asistencia. Este trabajo fue subsidiado por la Secretaría de Ciencia y Tecnología (Secyt 2008-2009).

Bibliografía    

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Vuong C, Kocianova S, Voyich JM, Yao Y, Fischer ER, Deleo FR et al. A crucial role for exopolysaccharide modification in bacterial biofilm formation, immune evasion, and virulence. J Biol Chem. 2004. 24;279(52):54881-6.

Comentarios

- Rafael Martínez Girón - ESPAÑA  (15/11/2009 15:30:55)

Muy interesante comunicación. Acabo de leer en "Diagnostic Cytopathology" algo sobre biofilms en un lavado broncoalveolar.
Saludos.

- MARIA GABRIELA PARAJE - ARGENTINA  (16/11/2009 4:12:33)

Gracias Rafael,buscaré ese trabajo que me resultará muy interesante.
Saludos,
Gabriela Paraje

- José Víctor Bolarín Lucas - ESPAÑA  (18/11/2009 10:36:39)

investigacion interesante para continuar realizando esperimento en este campo

- MARIA GABRIELA PARAJE - ARGENTINA  (28/11/2009 4:46:01)

Gracias José. El tema es muy interesante y tendrá grandes avances en el futruo. La teoría actual es que las bacterias se encuentran en la naturaleza formando biofilm. Este estado favorecería la cronicidad de la infección y es un importante factor de virulencia para evadir el sistema inmune, con importantes valores de resistencia a antibacterianos.
Esperamos poder continuar estudiando este tema y presentarlo en el futuro en las próximas ediciones de Conganat.
Felicitaciones por el nivel alcanzado y la calidad de los trabajos presentados y foros de discusión que se establecieron.

- José Luis Arce Diego - ESPAÑA  (29/11/2009 19:52:14)

Hola Natalia, Julio y demás colaboradores. Os felicito por el trabajo presentado en el que se demuestra, una vez más, la gran importancia que la microscopía confocal y las tecnologías ópticas en general tienen en el diagnóstico biomédico.