Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica
ISBN: 978-84-692-76778

COMUNICACIONES

1990. Patología Quirúrgica


Direccion de contacto
dearmas888@gmail.com yaxsier@ipk.sld.cu

Pneumocystis jirovecii en tejidos conservados en parafina de pacientes cubanos fallecidos por sida.

Yaxsier de Armas[1], Virginia Capó[1], Vicente Friaza[2], Anamays Govín[1], Elena Campano[2], Nieves Respaldiza[2], Carmen de La Horra[2], Enrique Calderón[2]
(1) Departamento de Anatomía Patológica, Instituto de Medicina Tropical ¨Pedro Kourí¨ (IPK), Ciudad de la Habana. CUBA
(2) Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Centro de Investigaciones Biomédica en Red sobre Epidemiología y Salud Pública (CIBERESP), Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla. ESPAÑA

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INTRODUCCIÓN: Pneumocystis jirovecii es uno de los patógenos oportunistas que afectan con más frecuentes a los pacientes con sida. Los tejidos fijados en formol y embebidos en parafina son las muestras más utilizadas en los laboratorios de patología. Estos tejidos pueden conservarse durante años, lo que permite su empleo en estudios de series históricas. Sin embargo, su utilización para estudios moleculares puede plantear algunos problemas y hasta este momento, existe escasa información en la literatura científica sobre su utilización para estudios genéticos de P. jirovecii. Por otra parte, no existe información sobre la distribución de genotipos de P. jirovecii en Cuba.

OBJETIVO: Comprobar la utilidad de las muestras conservadas en parafina para estudios genéticos y caracterizar los genotipos de P. jirovecii en pacientes cubanos infectados por el VIH fallecidos por una neumonía por este microorganismo.

MATERIALES Y MÉTODOS: Se emplearon 35 bloques de parafina procedentes de igual número de fallecidos cubanos por sida con neumonía por P. jirovecii en el período de 1995-2008. El diagnóstico histopatológico de P. jirovecii se realizó mediante la técnica de hematoxilina y eosina y la de plata metenamina de Gomori. El ADN fue extraído a partir de 5 cortes de 10 µm de cada fragmento de tejido pulmonar de cada fallecido. Para la caracterización genética del microorganismo en los tejidos parafinados, se amplificó la secuencia del gen que codifica para la subunidad mayor del ARN del ribosoma mitocondrial (mt LSU rRNA) de P. jirovecii mediante PCR simple o anidada y posterior secuenciación directa en las posiciones 85 y 248 del gen mt LSU rRNA. Además, en el estudió se emplearon dos juegos de cebadores que amplifican fragmentos de tallas diferentes del gen que codifica para la dihidropteroato sintetasa (DHPS) en P. jirovecii. El primer juego de cebadores amplifica un fragmento de 370 pb obtenido por una PCR-touchdown (PCR-TD), mientras que por un PCR simple se amplificó con el otro juego de cebadores un fragmento de 186 pb. El análisis de restricción de los productos amplificados de ambos PCR se realizó usando las enzimas Acc1 y Hae III.  

RESULTADOS: El fragmento de 260 pb del mt LSU rRNA se pudo amplificar en 26 (74,3 %) de los 35 bloques analizados. Hubo un predominio mayoritario del genotipo 3 (88,5%) en las muestras estudiadas. El 7,7% fueron genotipo 1, mientras que se constató un 3,8% de infección mixta (genotipo 2 y 3). Con el PCR-TD y el PCR simple de la DHPS se obtuvieron resultados similares (2 /26 y 3/26), respectivamente. Se demostró la ausencia de mutaciones en el gen de la DHPS, cuando los patrones correspondientes al genotipo salvaje fueron visualizados en gel de agarosa al aplicar la restricción enzimática.

CONCLUSIONES: En nuestro conocimiento, este el primer estudio que demuestra la utilidad de muestras conservadas en parafina durante años para realizar estudios genéticos de P. jirovecii. Por otra parte, aporta la primera información sobre la distribución de genotipos de P. jirovecii en Cuba, mostrando un predominio mantenido en el tiempo del genotipo 3. Finalmente se recomienda que para amplificar el gen unicopia de la DHPS en muestras parafinas estas deben contener una cantidad apreciable del microorganismo. Además, debe valorarse el empleo de cebadores que generen fragmentos cortos de la secuencia amplificada, así como el tiempo de fijación y conservación de la muestra para garantizar el éxito del PCR.

 


 

Introducción    

Pneumocystis jirovecii, conocido anteriormente como Pneumocystis carinii f. sp. hominis, continúa siendo uno de los más importantes patógenos oportunistas que afectan a individuos con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida).1
El diagnóstico convencional de este agente etiológico es realizado por métodos de tinciones como azul de toluidina, plata metenamina, giemsa y las técnicas de inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales. Sin embargo, todos estos procedimientos dependen de un alto grado de calidad de la muestra seleccionada.2
En la actualidad, los métodos moleculares han demostrado ser más efectivos en la detección de P. jirovecii que los métodos convencionales.3 Los tejidos fijados en formol y embebidos en parafina son las muestras más utilizadas en los laboratorios de patología y pueden conservarse durante años, lo que permite su empleo en estudios de series históricas. Sin embargo, su utilización para estudios moleculares puede plantear algunos problemas y hasta este momento, existe escasa información en la literatura científica sobre su utilización para estudios genéticos de P. jirovecii.  2-5
En el presente estudio, se comprobó la utilidad de las muestras conservadas en parafina para estudios genéticos y se caracterizó los genotipos de P. jirovecii en pacientes cubanos infectados por el VIH fallecidos por una neumonía de este microorganismo.

 

Materiales y Métodos    

Se utilizaron 35 bloques de parafina procedentes de igual número de fallecidos cubanos por sida con neumonía por P. jirovecii en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), Ciudad de La Habana, Cuba, desde 1995-2008. Se fijaron en formol tamponado fragmentos de tejido pulmonar de cada bloque estudiado y se procesaron por el método convencional para su inclusión en parafina. 6
A cada bloque se le realizó 2 cortes histológicos consecutivos de 5 µm de espesor con micrótomo rotario RM 2035 (Leica, Leizip, Alemania), que se colorearon con hematoxilina y eosina para sugerir evidencias de infección por P. jirovecii. Se tomaron otros 2 cortes de cada bloque, para ser empleados en coloraciones histológicas especiales para la identificación del hongo como la plata metenanima de Gomori. 6 Otros 5 cortes de 10 µm de cada bloque de parafina se colocaron en microtubos de 1,5 mL para realizar la extracción del material genético.
Para la extracción de ADN, a los cortes de tejido pulmonar obtenidos de cada fragmento procesado se les realizó dos lavados con xilol y dos con etanol, con centrifugaciones intermedias de 14 000 rpm por 10 min. El resto del proceso fue llevado a cabo como describe de la Horra y colaboradores utilizando el paquete comercial de (Quiagen, Alemania). 2 El ADN resultante se resuspendió en 75 µL de H20 destilada estéril, para su posterior empleo en la PCR.
Se utilizó como secuencia diana un fragmento de 260 pares de bases (pb) del gen que codifica para la subunidad mayor del ARN del ribosoma mitocondrial (mt LSU ARNr mt) de P. jirovecii.  7 La mezcla de reacción (50 µL) contuvo Tris/HCl (pH 8,3) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, deoxirribonucleótidos (dNTP) 200 µM, iniciador (X e Y) 0,4 µM, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Bioline, Londres, Reino Unido)  y 5 µL de ADN molde de cada fragmento empleado. El perfil de amplificación del PCR-TD fue: 95°C por 10 min, 94°C por 15 s,  65°C por 30 s, la temperatura fue disminuyendo hasta 55 °C un 1 °C por ciclo durante los 10 primeros ciclos, luego tratado 15 s a 72 °C . Los siguientes 40 ciclos fueron 15 s a 92 °C, 30 s a 55 °C y 15 s a 72 °C, con una extensión final de 5 min a 72 °C.
Además, en el estudio se emplearon dos juegos de cebadores que amplifican fragmentos de tallas diferentes del gen que codifica para la dihidropteroato sintetasa (DHPS) en P. jirovecii. El primer juego de cebadores amplifica un fragmento de 370 pb obtenido por una PCR-TD. 2 La mezcla de reacción para este fragmento (25 µL) contuvo Tris/HCl (pH 8,3) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, deoxirribonucleótidos (dNTP) 200 µM, iniciador (DHPS-3 y DHPS-4) 0,4 µM, 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Bioline, Londres, Reino Unido) y 3 µL de ADN molde de cada fragmento empleado. El perfil de amplificación del PCR-TD fue: 95°C por 10 min, 94°C por 15 s, 72°C por 30 s, la temperatura fue disminuyendo hasta 62°C un 1°C por ciclo durante los 10 primeros ciclos, luego tratado 15 s a 72°C . Los siguientes 40 ciclos fueron 15 s a 92°C, 30 s a 62°C y 15 s a 72°C, con una extensión final de 5 min a 72°C. Para el PCR simple de la DHPS, que amplifica un fragmento de 186 pb, fueron las mismas condiciones de reacción que la PCR-TD. Sólo varió el empleo de los cebadores NR y NF descrito por Costa y colaboradores. 8 El perfil de amplificación del PCR simple fue: 95 °C por 3 min, 35 ciclos a 94°C por 1 min, 62°C por 1 min y 72°C 1 min con una extensión final de 5 min a 72°C.
Para la restricción enzimática de ambos productos de PCR de la DHPS, se incubaron 1 U de las enzimas Acc1 y Hae III  durante dos horas.
Para la detección de todos los productos amplificados y los patrones de restricción se analizaron 8 µL de cada mezcla resultante mediante electroforesis en gel de agarosa 2 % con solución reguladora de Tris-borato-EDTA.
La secuenciación directa de las posiciones 85 y 248 del gen mt LSU rRNA fueron llevadas a cabo según lo descrito por Beard y colaboradores. 9

 

Resultados    

El fragmento de 260 pb del mt LSU rRNA se pudo amplificar en 26 (74,3 %) de los 35 bloques analizados. Hubo un predominio mayoritario del genotipo 3 (88,5 %) en las muestras estudiadas. El 7,7 % fueron genotipo 1, mientras que se constató un 3,8 % de infección mixta (genotipo 2 y 3). Con el PCR-TD y el PCR simple de la DHPS se obtuvieron resultados similares (2/26 y 3/26), respectivamente. Se demostró la ausencia de mutaciones en el gen de la DHPS, cuando los patrones correspondientes al genotipo salvaje fueron visualizados en gel de agarosa al aplicar la restricción enzimática.

 

Discusión    

En nuestro conocimiento, este el primer estudio que demuestra la utilidad de muestras conservadas en parafina durante años para realizar estudios genéticos de P. jirovecii. Por otra parte, aporta la primera información sobre la distribución de genotipos de P. jirovecii en Cuba, mostrando un predominio mantenido en el tiempo del genotipo 3. Similares resultados fueron obtenidos por Miller y colaboradores que lograron identificar este mismo genotipo en muestras provenientes de Zimbabwe. 10 En cambio los datos obtenidos en esta investigación difieren de los reportados por Beard 9 y Montes-Canos 11 en USA y España respectivamente. Estos autores demostraron el predominio del genotipo 1. Los hallazgos obtenidos en esta investigación corroboran la diferente distribución de genotipos por diferentes regiones geográficas del mundo. 9
Es válido destacar que un bajo porciento de co-infecciones fue detectado en las muestras cubanas, similar a los datos reportados de España (3,7 %) 11 y diferentes de EUA (10,2 %) 9 y Reino Unido (10 %). 10 Una posible explicación al respecto es el estrecho contacto que tienen los pacientes cubanos con VIH entre ellos, sugiriendo una posible transmisión por vía aérea del mismo genotipo. Además, existe una alta probabilidad de que el paciente se infecte con el genotipo 3 debido a que es el genotipo predominante en el país.
A pesar de lograr amplificar el 74,3 % de las muestras, se conoce el efecto de degradación que sufre el ADN en las muestras parafinadas, así como su pobre rendimiento a la hora de amplificar las mismas por PCR. Por lo que ha llevado a muchos investigadores a realizar cambios o variantes en los protocolos que utilizan. 12 En nuestro caso, al ser el mt LSU rRNA una secuencia repetitiva en el genoma del patógeno y su producto amplificación de baja talla molecular (260 pb), los resultados fueron satisfactorios.
Los datos obtenidos en esta investigación demuestran la estabilidad y la utilidad del empleo del mt LSU rRNA para estudios de epidemiología molecular como ya ha sido descrito anteriormente. 10
El gen de la DHPS no sólo ha sido utilizado para estudios de epidemiología molecular, sino que se ha asociado las mutaciones puntuales existente en el gen con la resistencia a sulfamidas, fármaco principal de elección para la tratar la infección de P. jirovecii. 9 En este trabajo, se evidenció la ausencia de mutaciones puntuales en las muestras de los fallecidos cubanos. Sin embargo, conclusiones generales no pueden ser extraídas debido al bajo número de muestras amplificadas que se obtuvieron en el estudio. Desafortunadamente, la presencia de una única copia del gen de la DHPS en el genoma de P jirovecii y el tamaño del fragmento amplificado (370 pb) favoreció la baja tasa de amplificación en las muestras (2/26). Por otra parte, a pesar de reducir el tamaño del fragmento amplificado similares resultados fueron obtenidos (3/26), sugiriendo el papel importante de la repetición de la secuencia en el genoma del microorganismo. Está descrito en la literatura tasas de amplificación de este gen de hasta 75% en muestras no parafinadas. 13 Robberts y colaboradores empleando un simple PCR de la DHPS no logró resultados exitosos en 12 muestras parafinadas (0/12). Sin embargo, al emplear una PCR anidada obtuvo un 42 % empleando este tipo de muestras. 14 Nosotros evaluaremos en futuros estudios, la factibilidad de la PCR anidada con cebadores pequeño, así como el empleo de la PCR  a tiempo real sobre este tipo de muestras.
Finalmente, este estudio sugiere que debe valorarse el empleo de cebadores que generen fragmentos cortos de la secuencia repetitiva que se amplifica, así como el tiempo de fijación y conservación de la muestra en parafina para garantizar el éxito del PCR.

 

Bibliografía    

1. Thomas CFJr, Limper AH. Current insights into the biology and pathogenesis of Pneumocystispneumonia. Nat Rev Microbiol. 2007;5:298-308.
2. De La Horra C, Varela JM, Friaza V, Respaldiza N, Munoz-Lobato F, Montes-Cano M, et al. Comparison of single and touchdown PCR protocols for detecting Pneumocystis jirovecii DNA in paraffin-embedded lung tissue samples. J Eukaryot Microbiol. 2006;53:S98-9.
3. Helweg-Larsen J, Lundgren B, Lundgren JD. Heterogeneity and compartmentalization of Pneumocystis carinii f.sp.hominis genotypes in autopsy lungs. J Clin Microbiol. 2001;39:3789-92.
 
4. Varela JM, Fernández-Alonso J, Wichmann I, Calderón EJ. Pneumocystis carinii investigation in patients with Wegener`s Granulomatosis. Br J Rheumatol. 1998;37:349-50.
 
5. Chabé M, Vargas SL, Eyzaguirre I, Aliooaut EM, Follet-Dumoulin A, Creusy C. Molecular typing of Pneumocystis jirovecii found in formalin-fixed paraffin-embedded lung tissue sections from sudden infant death victims. Microbiol. 2004;150:1167-72.
 
6. Luna LG, editors. Manual of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3ra. ed. New York: McGraw-Hill, Inc; 1967.
 
7. Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet.1990;336:451-3
 
8. Costa MC, Gaspar J, Manshino K, Esteves F, Antunes F, Matos O. Detection of Pneumocystis jirovecii dihydropteroate synthase polymorphisms in patients with Pneumocystis pneumonia. Scan J Infect Dis.2005;37:766-71    
 
9. Beard C, Fox MR, Lawrence GG, Guarner J, Hanzlick RL, Huang L, et al. Genetic differences in Pneumocystis isolates recovered from immunocompetent infants and from adults with Aids: Epidemiological implications. J Inf Dis. 2005;192:1815-8.
 
10. Miller RF, Lindley AR, Ambrose HE, Wakefield AE. Genotypes of  Pneumocystis jiroveci isolates obtained in Harare, Zimbabwe, and London , United Kindong. Antimicrob Agents Chemother 2003;47:3979-81.
 
11.Montes-Cano MA, de la Horra C, Martín-Juan, Calderón E.  Pneumocystis jiroveci genotypes in the Spanish population. Clin Infect Dis 2004;39:123-8.  
 
12. Wu L, Patten N, Yamashiro CT, Chui B. Extraction and amplification of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 2002;10:269-74.
 
13. Calderón E, de la Horra C, Montes-Cano MA, Respaldiza N, Martín-Juan J, Varela JM. Resistencia genotípica a sulfamidas en pacientes con neumonía por Pneumocystis jiroveci. Med Clin (Barc) 2004;12:617-9. 
 
14. Robberts JL, Liebowitz LD, Chalkley LJ. Polymerase chain reaction detection of Pneumocystis jiroveci: evaluation of 9 assays. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;58:385-92. 

 

Comentarios

- Amparo de la Candelaria Rivera Valdespino - CUBA  (05/11/2009 18:58:18)

Muy bonito trabajo e interesante

- Susana Hernandez Delgado - CUBA  (10/11/2009 3:14:34)

Muy interesante su trabajo y pudiera resultar de garn utilidad en este tipo de pacientes, felicitaciones

- Gladys Rafaela Cirion Martinez - CUBA  (13/11/2009 13:22:34)

Muy interesante el trabajo

- Cira J Velasco Elizalde - CUBA  (16/11/2009 5:38:10)

Importante e interesante trabajo, lástima que no tenga ilustración. Felicidades.

- Rafael Martínez Girón - ESPAÑA  (16/11/2009 10:09:57)

Me gustaría aportar a la bibliografía una referencia que puede ser interesante:

de la horra et al. Association between human-Pneumocystis infection and small-cell lung carcinoma. Eur J Clin Invest 2004; 34 (3): 229-35.

Enhorabuena por el trabajo.
Saludos cordiales desde Asturias.

- MARTHA ESTHER LARREA FABRA - REPUBLICA SUDAFRICANA  (19/11/2009 6:50:04)

Trabajo muy bueno. Completaria con algunas imagenes. Gracias por toda la informacion, saludos.

- Emilio Mayayo Artal - ESPAÑA  (24/11/2009 23:56:06)

Felicidades por el trabajo. Os animo a seguir en la brecha de la patología infecciosa.

 

 

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