ISBN: 978-84-692-76778
COMUNICACIONES
Nº 1940. Otras disciplinas
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Estudio por análisis de imagen de fibrosis hepática en un modelo de colestasis experimental en ratas María Teresa Corcuera Pindado[1], Fernando Gómez Aguado[1], Fernando Sánchez Patán[2], María-Angeles Aller[2], Daniel Val Garijo[1], Jaime Arias[2], María José Alonso Martín[1] |
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surgical abortion vs medical abortionmedical vs surgical abortionviagra prodej brnoviagraINTRODUCCIÓN: Recientemente se ha desarrollado un nuevo modelo de colestasis extrahepática experimental en ratas mediante técnica microquirúrgica para estudiar la fibrosis hepática. Se plantea un trabajo de análisis de imagen para objetivar la fibrosis hepática a medio y largo plazo en este modelo.
MATERIAL Y MÉTODOS: Ratas Wistar macho (n=64) fueron divididas en seis grupos:
- Controles: grupo I (n=5, cuatro semanas de evolución), grupo II (n=5, seis semanas de evolución) y grupo III (n=5, ocho semanas de evolución), de ratas pseudooperadas a las que se diseccionó el conducto biliar sin ligarlo.
- Experimentales: grupo IV (n=10, cuatro semanas de evolución), grupo V (n=20, seis semanas de evolución) y grupo VI (n=19, ocho semanas de evolución), de ratas sometidas a colestasis microquirúrgica, a las que se ligaron y seccionaron el conducto biliar común y los conductos biliares que drenan los lóbulos hepáticos.
Tras el período de evolución, los animales se sacrificaron, se extrajo el hígado y se procedió a su estudio microscópico mediante las tinciones de Hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson, reticulina y rojo sirio. Se cuantificó la fibrosis mediante análisis de imagen a partir de secciones teñidas con rojo sirio y los resultados obtenidos se trataron por métodos estadísticos.
RESULTADOS: Los animales de los grupos control no presentaron alteraciones morfológicas hepáticas. Los animales del grupo IV presentaban moderada proliferación ductular, ligera inflamación portal y fibrosis severa. Los animales de los grupos V y VI, presentaron, de forma uniforme, intensa alteración arquitectural a expensas de una intensa proliferación ductular, fibrosis muy severa y moderada apoptosis. Mediante análisis de imagen se objetivó diferencia estadística significativa en la cantidad de colágeno teñido con rojo sirio presente en el tejido hepático entre cada grupo experimental y su correspondiente grupo control (p<10-6). También se demostró diferencia estadística significativa entre los grupos IV y V, y entre los grupos IV y VI. No se constató diferencia entre los grupos V y VI.
DISCUSIÓN: La colestasis extrahepática microquirúrgica produce un modelo reproducible de fibrosis biliar a largo plazo, lo que asociado a la cuantificación mediante análisis de imagen del colágeno teñido con la técnica de rojo sirio, lo convierte en un modelo experimental idóneo para estudiar la reversibilidad de la fibrosis hepática mediante terapias antifibróticas.
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Recientemente, este equipo de investigación desarrolló un nuevo modelo experimental de colestasis extrahepática microquirúrgica en ratas (1,2), caracterizado histológicamente por proliferación de ductos biliares y fibrosis en el tejido hepático. Dado que el grado de fibrosis es uno de los parámetros más importantes en el estudio histopatológico de biopsias hepáticas, sobre todo para valorar la evolución de lesiones crónicas, en el presente trabajo se planteó cuantificar objetivamente, mediante análisis de imagen, la evolución de la fibrosis hepática observada en este modelo animal tras cuatro, seis y ocho semanas de evolución postoperatoria.
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Diseño experimental:
Se utilizaron 44 ratas macho Wistar de 230 a 270 g de peso corporal, divididas en seis grupos:
Grupo I (n=5): grupo control de ratas pseudooperadas a las que se diseccionó el conducto biliar sin ligarlo. Se sacrificaron tras cuatro semanas de evolución postoperatoria.
Grupo II (n=5): grupo control de ratas pseudooperadas, sacrificadas tras seis semanas de evolución postoperatoria.
Grupo III (n=5): grupo control de ratas pseudooperadas, sacrificadas tras ocho semanas de evolución postoperatoria.
Grupo IV (n =10): ratas sometidas a colestasis microquirúrgica, a las que se ligaron y seccionaron el conducto biliar común y los conductos biliares que drenan los cuatro lóbulos hepáticos. Se sacrificaron tras cuatro semanas de evolución postoperatoria.
Grupo V (n=20): ratas sometidas a colestasis microquirúrgica y sacrificadas tras seis semanas de evolución postoperatoria.
Grupo VI (n=19): ratas sometidas a colestasis microquirúrgica y sacrificadas tras ocho semanas de evolución postoperatoria.
Estudio histopatológico
El hígado de los animales sacrificados se procesó de forma rutinaria mediante fijación en formol e inclusión en parafina. Secciones de 4 µm se tiñeron con las técnicas de Hematoxilina-eosina, Tricrómico de Masson, Reticulina y Rojo sirio para su estudio microscópico.
Análisis de imagen
Se captaron imágenes digitalizadas de secciones teñidas con Rojo sirio mediante un fotomicroscopio Leica DM 5000 B y se analizaron con un software específico de análisis de imagen (Leica QWin) para cuantificar el área ocupada por el colágeno teñido como una medida indirecta de la fibrosis hepática.
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos con análisis de imagen se expresaron como la media +/- desviación estándar. Se valoró la significación estadística de la variable cuantitativa estudiada mediante el test t-Student para datos no pareados.
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En los animales de los grupos control (grupos I, II y III) no se observaron alteraciones morfológicas hepáticas (fig. 1).
El tejido hepático de los animales del grupo IV presentaba ligera inflamación portal, moderada proliferación ductular y fibrosis severa (figs. 2 y 3).
En los hígados de los animales de los grupos V y VI, se observó de forma unánime una marcada alteración de la arquitectura hepática a expensas de una intensa proliferación ductular, observándose moderada apoptosis y fibrosis muy severa (figs. 4 y 5).
Los resultados cuantitativos obtenidos mediante análisis de imagen se muestran en la tabla I.
Tabla I. Resultado del test t-Student obtenido al comparar los distintos grupos estudiados. En color rojo se presentan los hallazgos con diferencia estadísticamente significativa. Las cifras entre paréntesis debajo de cada grupo corresponden a la media ± desviación estándar del área ocupada por colágeno teñido con el rojo sirio.
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La ligadura macroquirúrgica del ducto biliar común en ratas es un modelo experimental usado para estudiar la hipertensión portal y la colestasis extrahepática (3). Sin embargo, este modelo sólo permite estudios a corto plazo, ya que los animales mueren a las 2-3 semanas de evolución postoperatoria. Esto es debido a la formación de seudoquistes infectados por dilatación del extremo proximal del conducto biliar que da lugar a sepsis causada por múltiples abscesos intraperitoneales, hepáticos y pulmonares. La técnica microquirúrgica empleada en este estudio, consistente en la resección, tanto del ducto biliar común, como de los ductos biliares que drenan cada uno de los cuatro lóbulos hepáticos, solventa estos problemas, reduciendo la mortalidad. Ello permite crear un modelo de fibrosis biliar a largo plazo (ocho semanas). Los resultados obtenidos muestran una uniformidad evolutiva en la lesión hepática, caracterizada por una proliferación ductular biliar progresiva, que sustituye el parénquima hepático. Simultáneamente, aparece un componente fibrótico, que aumenta progresivamente hasta alcanzar valores por encima del 20% del área hepática total. A las seis semanas de evolución postoperatoria la arquitectura hepática se ha transformado y sustituido por completo, quedando sólo nidos aislados de hepatocitos atrapados entre los ductos proliferados. Esta lesión se mantiene prácticamente igual a las ocho semanas de evolución postoperatoria. Por otra parte, la gradación de la fibrosis depende de la cantidad de colágeno presente en la sección hepática (4). Por ello la tinción de Rojo sirio, específica del colágeno, es ideal para establecer el grado de fibrosis hepática. La cuantificación mediante análisis de imagen del área ocupada por rojo sirio es una técnica idónea para medir de forma indirecta el grado de fibrosis hepática, aportando además objetividad y repetibilidad (5-9). Por esto podemos concluir que la técnica microquirúrgica utilizada, junto con la cuantificación del colágeno con análisis de imagen, resulta un modelo experimental idóneo para futuros estudios de reversibilidad de la fibrosis hepática mediante terapias antifibróticas.
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1 - Sánchez-Patán F, Anchuelo R, Corcuera MT et al. Biliar fibrosis in microsurgical extrahepatic cholestasis in the rat. Microsurg 2008, 28:361-363.
2. Corcuera MT, Sánchez –Patán F, Casado I et al. Histopatología y bioquímica hepáticas en un nuevo modelo de colestasis extrahepática en ratas. http://conganat.cs.urjc.es/index.php/conganat/article/viewPDFInterstitial/276/339
3 - Katsuta Y, Zhang XJ, Ohsuga M et al. Hemodynamic features of advanced cirrhosis due to chronic bile duct ligation. J Nippon Med Sch 2005;72:217-225
4 - Standish RA, Cholongitas E, Dhillon A et al. An appraisal of the histopathological assesmant of liver fibrosis. Gut 2006;55:569-578
5 -JamesJb, Bosch KS, Aronson DC, HouthKooper JM. Sirius red histophotometry and spectrophotometry of sections in the assessment of the collagen content of liver tissue and application in growing rat liver. Liver 1990 ,10:1-5
6 - Lazzarini Al, Levine Ra, Ploutz RJ, Sanderson SO. Advances in digital quantification technique enhance discrimination between mild and advanced liver fibrosis in chronic hepatitis c. Liver Int 2005;25(6):1142-1149
7 - Wrigt M, Thursz M, Pullen R, Thomas H, goldin R. quantitative versus morphological assessment of liver fibrosis: semi-quantitative scores are more robust than digital image fibrosis area estimation. Liver int 2003;23(1):28-34.
8 - Masseroli M, O’Valle F, caballero T et al. Fibrosis HR, una nueva aplicación de análisis de imagen para la cuantificación automática de la fibrosis hepática. http://www.uninet.edu/conganat/IVCVHAP/com056
9 - Huy AY, Liew CT, Go MY,et al. quantitative assasment of fibrosis in liver biopsies from patients with chronic hepatitis B. Liver Int 2004; 24(6):611-618
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- Rosa María Coro-Antich - CUBA (30/10/2009 18:32:12)
- MARIA TERESA CORCUERA PINDADO - ESPAÑA (Autor) (05/11/2009 9:35:12)
- IGNACIO J. CLAROS GONZÁLEZ - ESPAÑA (14/11/2009 10:54:14)
- MARIA TERESA CORCUERA PINDADO - ESPAÑA (Autor) (16/11/2009 9:55:58)
- isabel casado fariñas - ESPAÑA (18/11/2009 20:10:35)
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