Congreso Virtual sobre Anatomía Patológica
ISBN: 978-84-692-76778

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1850. Patología Quirúrgica


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Estudio del efecto de los quimioterápicos Doxorubicina y Etopósido y del Acido Retinoico en la línea celular de neuroblastoma SK-N-FI

Idoia Blanco Luquin[1], Jon Celay Leoz[1], Javier Saez Castresana[2], Paula Lázcoz Ripoll[1], Ignacio José Encío Martínez[1]
(1) Dpto. Ciencias de la Salud, Universidad Pública de Navarra. ESPAÑA
(2) Unidad de Biología de Tumores Cerebrales, Universidad de Navarra. ESPAÑA

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INTRODUCCIÓN
El neuroblastoma es un tumor maligno embrionario infantil, del sistema nervioso periférico, que a menudo presenta mal pronóstico. A pesar de que el gen p53 está alterado en más del 50% de los cánceres, aparece mutado en un porcentaje muy bajo de neuroblastomas. Sin embargo, estudios previos describen un aumento de la resistencia al tratamiento con quimioterápicos en los neuroblastomas que presentan mutación de este gen.

MATERIAL Y MÉTODOS
En este estudio se determinó el efecto de la doxorubicina, el etopósido y el ácido retinoico (en sus formas 9-cis y todo-trans), en la línea celular de neuroblastoma SK-N-FI, en la que se había detectado previamente una mutación en el extremo 5´ del exón 5 del gen p53. Para todos ellos se analizó la posible inducción de apoptosis por la técnica de TUNEL y la alteración del ciclo celular empleando yoduro de propidio a 12, 24, 72 horas y 5 días.

RESULTADOS
Se observó un aumento estadísticamente significativo de la apoptosis en todos los casos a los 5 días, si bien para la doxorubicina y el ácido retinoico en su forma 9-cis este incremento era ya apreciable incluso a 72 horas.
En cuanto al ciclo celular, la doxorubicina desencadenaría una disminución del número de células en fase G0/G1, acompañada de un aumento de éstas en S y G2 a tiempos cortos para, a tiempos más largos, inducir el aumento de la fase Sub-G0. Por su parte, en el caso del etopósido tan sólo se observó un descenso de las células presentes en fase G1 a largo plazo. Finalmente, el ácido retinoico originaría incremento de la fase SubG0 de dos maneras distintas: la forma 9-cis ocasionaría a corto plazo una acumulación de células en G1 que a tiempos largos comenzarían a morir, mientras que la forma todo-trans no produciría acumulación de células en fase G1. En todos los casos los cambios observados fueron estadísticamente significativos.

CONCLUSIÓN
El tratamiento con doxorubicina, etopósido y ácido retinoico (en sus formas 9-cis y todo-trans) sobre la línea celular de neuroblastoma SK-N-FI parece inducir un aumento de la apoptosis y alteración en el ciclo celular.


 

Introducción    

El neuroblastoma es un tumor maligno embrionario infantil, del sistema nervioso periférico, que a menudo presenta mal pronóstico. A pesar de los tratamientos existentes en la actualidad, produce el 5% de las muertes debidas al cáncer infantil. Las alteraciones genéticas más características de este tumor son: pérdidas alélicas en 1p y 11q, alteraciones en la ploidía, amplificación de MYCN, ganancias en 17q, expresión de receptores de neurotrofinas, actividad telomerasa y expresión de CD44.
 
Inicialmente, la mayoría de los neuroblastomas responden a la terapia citotóxica y la radioterapia regional. Sin embargo, varios casos presentan recidivas con diferentes niveles de resistencia a quimioterápicos.

A pesar de que el gen p53 está alterado en más del 50% de los cánceres, aparece mutado en un porcentaje muy bajo de neuroblastomas en el momento del diagnóstico. Sin embargo, estudios previos describen un aumento de la resistencia al tratamiento con quimioterápicos en los neuroblastomas que presentan mutación de este gen.

Análisis de secuenciación llevados a cabo con anterioridad por nuestro grupo mostraron una mutación puntual, no conservativa, en el extremo 5´ del exón 5 del gen p53 en la línea celular de neuroblastoma SK-N-FI. El cambio de una base, guanina por timina, en el codón 135, suponía la sustitución del aminoácido cisteína (Cys, triplete TGC) por fenilalanina (Phe, triplete TTC).

 

Material y Métodos    

Este estudio pretende observar el efecto que los quimioterápicos doxorubicina y etopósido y el ácido retinoico (en sus formas 9-cis y todo-trans)  producen sobre la línea celular de neuroblastoma SK-N-FI, con p53 mutado. Además, nos planteamos analizar la capacidad de los isómeros todo-trans y 9-cis del ácido retinoico para inducir la diferenciación y/o apoptosis de las líneas celulares de neuroblastoma SK-N-DZ y SK-N-Be(2) y estudiar su efecto sobre el ciclo celular y la expresión de 84 genes relacionados con el proceso de apoptosis por PCR cuantitativa. 

Para todos ellos se analizó por citometría de flujo la posible inducción de apoptosis mediante la técnica de TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labelling) utilizando el sistema Apo- Direct kit (Pharmingen) y la alteración del ciclo celular empleando yoduro de propidio a 12, 24, 72 horas y 5 días.

 

Resultados    

Se observó un aumento estadísticamente significativo de la apoptosis en todos los casos a los 5 días, si bien para la doxorubicina y el ácido retinoico en su forma 9-cis este incremento era ya apreciable incluso a 72 horas.

Para el ácido retinoico los resultados obtenidos muestran que el tratamiento induce un aumento significativo en los niveles de diferenciación y apoptosis de los cultivos. Sin embargo, aunque la respuesta final al tratamiento de las líneas celulares es la misma, esto es diferenciación y apoptosis, el efecto sobre la transcripción depende de la línea celular y el isómero empleado. Así, el tratamiento con el isómero 9-cis del ácido retinoico induce más de 2 veces los niveles de expresión de los genes BCL2A1, CIAP2, CASP1, CASP10, CASP14,  CASP5, CASP8, NOL3, TNFRSF11B, CD137 y TRAIL en células SK-N-DZ y de los genes BIK, TNFRIII, PYCARD, TNF-RI,  TRAIL-RII y DR3 en células SK-N-Be(2), mientras que disminuye a menos del 50% los niveles de expresión de los genes HRK y TNF en células SK-N-DZ y de los genes CD27, TP73 y BCL2L10 en células SK-N-Be(2).

En cuanto al ciclo celular, la doxorubicina desencadenaría una disminución del número de células en fase G0/G1, acompañada de un aumento de éstas en S y G2 a tiempos cortos para, a tiempos más largos, inducir el aumento de la fase Sub-G0.
 
Por su parte, en el caso del etopósido tan sólo se observó un descenso de las células presentes en fase G1 a largo plazo.

Finalmente, el ácido retinoico originaría incremento de la fase SubG0 de dos maneras distintas: la forma 9-cis ocasionaría a corto plazo una acumulación de células en G1 que a tiempos largos comenzarían a morir, mientras que la forma todo-trans no produciría acumulación de células en fase G1.

En todos los casos los cambios observados fueron estadísticamente significativos.

 

Figura 1. Detección de apoptosis para el quimioterápico doxorubicina a 12 y 24 horas y a 3 y 5 días.
Figura 1. Detección de apoptosis para el quimioterápico doxorubicina a 12 y 24 horas y a 3 y 5 días.


Figura 2. Detección de apoptosis para el quimioterápico etopósido a 12 y 24 horas y a 3 y 5 días.
Figura 2. Detección de apoptosis para el quimioterápico etopósido a 12 y 24 horas y a 3 y 5 días.


Figura 3. Detección de apoptosis para el ácido retinoico en sus dos isoformas a 12 y 24 horas y a 3 y 5 días.
Figura 3. Detección de apoptosis para el ácido retinoico en sus dos isoformas a 12 y 24 horas y a 3 y 5 días.


Figura 4. Efecto sobre las distintas fases del ciclo celular de la doxorubicina.
Figura 4. Efecto sobre las distintas fases del ciclo celular de la doxorubicina.


Figura 5. Efecto sobre las distintas fases del ciclo celular del etopósido.
Figura 5. Efecto sobre las distintas fases del ciclo celular del etopósido.


Figura 6. Efecto sobre las distintas fases del ciclo celular del ácido retinoico.
Figura 6. Efecto sobre las distintas fases del ciclo celular del ácido retinoico.


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Discusión    

Se ha observado que los tratamientos con diferentes isómeros del ácido retinoico dan lugar a una reducción de la población celular tratada, sin embargo el efecto sobre la transcripción depende de la línea celular y el isómero empleado.

Este resultado sugiere que el contexto celular es una variable importante en el proceso de diferenciación y/o apoptosis inducido por el ácido retinoico en células de neuroblastoma.

Asimismo, esto lleva a pensar que probablemente el efecto de los quimioterápicos doxorubicina y etopósido,  en cuanto a apoptosis y ciclo celular, diferiría dependiendo de la línea celular de neuroblastoma sobre la que actúen.

 

Conclusiones    

El tratamiento con doxorubicina, etopósido y ácido retinoico (en sus formas 9-cis y todo-trans) sobre la línea celular de neuroblastoma SK-N-FI parece inducir un aumento de la apoptosis y alteración en el ciclo celular.

Además, las dos isoformas del ácido retinoico producen un aumento significativo en la diferenciación y apoptosis de las líneas celulares SK-N-DZ y SK-N-Be(2), variando los niveles de expresión de ciertos genes dependiendo del isómero y la línea celular.

 

Bibliografía    

1. Tweddle DA, Pearson AD, Haber M, et al. The p53 pathway and its inactivation in neuroblastoma. Cancer Lett 2003;197:93–8.

2. Xue C, Haber M, Flemming C, Marshall GM, Lock RB, MacKenzie KL, Gurova KV, Norris MD, Gudkov AV. p53 determines multidrug sensitivity of childhood neuroblastoma. Cancer Res. 2007 Nov 1;67(21):10351-60.

3. Keshelava N, Zuo JJ, Chen P, Waidyaratne SN, Luna MC, Gomer CJ, Triche TJ, Reynolds CP. Loss of p53 function confers high-level multidrug resistance in neuroblastoma cell lines. Cancer Res. 2001 Aug 15;61(16):6185-93.

4. Kurata K, Yanagisawa R, Ohira M, Kitagawa M, Nakagawara A, Kamijo T. Stress via p53 pathway causes apoptosis by mitochondrial Noxa upregulation in doxorubicin-treated neuroblastoma cells. Oncogene. 2008 Jan 31;27(6):741-54. Epub 2007 Aug 20.

5. Jeyapalan J, Leake A, Ahmed S, Saretzki G, Tilby M, von Zglinicki T. The role of telomeres in Etoposide induced tumor cell death. Cell Cycle. 2004 Sep;3(9):1169-76. Epub 2004 Sep 13.

6. Lovat, P.E., et al., Apoptosis of N-type neuroblastoma cells after differentiation with 9-cis-retinoic acid and subsequent washout. J Natl Cancer Inst, 1997. 89(6): p. 446-52.

7. Oppenheimer, O., N.K. Cheung, and W.L. Gerald, The RET oncogene is a critical component of transcriptional programs associated with retinoic acid-induced differentiation in neuroblastoma. Mol Cancer Ther, 2007. 6(4): p. 1300-9.

8. Nagai J, Yazawa T, Okudela K, Kigasawa H, Kitamura H, Osaka H. Retinoic acid induces neuroblastoma cell death by inhibiting proteasomal degradation of retinoic acid receptor alpha. Cancer Res. 2004 Nov 1;64(21):7910-7.

 

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