Modificación en la expresión inmunohistoquímica de poli[ADP-Ribosa] polimerasa-1 en hepatocarcinomas sobre hígados cirróticos.

Francisco O’Valle^[1], Jose Antonio Muñoz-Gámez^[2], Trinidad Caballero^[1], Jorge A. Payá^[1], Mercedes Caba^[1], Mohamed Tassi^[1], Rosa Quiles-Pérez^[2], Javier Salmerón^[2], Raimundo García del Moral^[1]
(1) Departamento de Anatomía Patológica e IBIMER, Facultad de Medicina, Granada. ESPAÑA
(2) Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (Ciberehd). Hospital Universitario San Cecilio, Granada, Spain, ESPAÑA

La Poli[adenosina difosfato (ADP)-ribosa] polimerasa-1 (PARP-1), de localización nuclear, cataliza la poli-ADP-ribosilación asociada con diferentes eventos biológicos como la reparación del ADN, la proliferación celular y la transformación neoplásica. El objetivo del estudio, empleando biopsias hepáticas, fue evaluar la expresión nuclear de PARP-1. Material y Métodos: Fueron valoradas 20 lóbulos hepáticos resecados por hepatocarcionomas (HCC) con diferente grado histológico (10 bien diferenciado y 10 moderadamente diferenciado) desarrollados sobre cirrosis de diversa etiología (VHC=7, VHB=6, Etanol=7) procedentes de 18 hombres y 2 mujeres con una edad media de 52±9 años y 10 biopsias control correspondientes a hígados normales. La valoración inmunohistoquímica se realizó valorando número de núcleos teñidos por mm² y la intensidad semicuantitativamente en una escala de 0 a 3+ con el anticuerpo monoclonal frente a PARP-1 (clón A6.4.12). Resultados: La expresión de PARP-1 en los HCC fue masiva e intensa (3+) con 1828±163 núcleos por mm² frente a la expresión débil (1+) en 424±109 núcleos por mm² en las áreas de cirrosis (p<0.001). Los controles mostraron un número de células positivas para PARP-1 de 1361.29±72.99 con intensidad (2+/3+). No encontramos diferencia significativa de expresión de PARP-1 en función del grado de diferenciación del HCC. La pérdida de expresión de PARP-1 (en número de células e intensidad) en el hígado cirrótico podría contribuir al desarrollo de HCC como se ha demostrado en ratones Parp-1 knockout.

Introducción    

El hepatocarcinoma (HCC) es una de las neoplasias más comunes a nivel mundial y su frecuencia está aumentado (1). La poli(ADP-ribosa)polimerasa-1 PARP-1 (E.C. 2.4.2.30) es una proteína nuclear de 116 kDa de masa molecular con dos motivos en dedo de zinc, que se fija al ADN y detecta específicamente mellas o rupturas del ADN producidas por diferentes agentes genotóxicos (2). PARP-1 cataliza la poli-ADP-ribosilación de proteínas diana en respuesta al daño del ADN y ha sido propuesto que desempeña un importante papel en diferentes eventos biológicos como la reparación del ADN, la muerte  y en la proliferación celular, la transformación neoplásica, así como en la estabilización del genoma (3, 4) .

Objetivo    

Material y Métodos    

Fueron valorados 20 lóbulos hepáticos resecados por HCC desarrollados sobre cirrosis de diversa etiología (VHC=7, VHB=6, Etanol=7) procedentes de 18 hombres y 2 mujeres con una edad media de 52±9 años y 10 biopsias control correspondientes a hígados normales. Las muestras fuero fijadas en formalina tamponada e incluidas en parafina. Para la técnica inmunohistoquímica, realizada sobre secciones de 4 micras, se empleó el anticuerpo monoclonal frente a PARP-1 (clón A6.4.12) (Master Diagnóstica,  Granada, España) a dilución 1:50 con el sistema de visualización MasVision basado en método de polímero conjugado con peroxidada y revelado con DAB (Master Diagnóstica).  La valoración inmunohistoquímica se realizó cuantificando el número de núcleos teñidos por mm², empleando el objetivo de 40x y una gradilla milimetrada colocada en el ocular de un microscopio Olympus BH2. El número resultante fue dividido por el factor de corrección 0.062 establecido para dicha magnificación y la intensidad fue valorada semicuantitativamente en una escala de 0 a 3+.

Resultados    

Fueron analizados 20 HCC con diferente grado histológico (10 bien diferenciado y 10 moderadamente diferenciado). El tamaño medio de las neoplasias fue 25 ± 10 mm y el número de lesiones por lóbulo fue 1.6 ± 0.8. La expresión de PARP-1 en los HCC fue masiva e intensa (3+) (Figura 1) con 1828±163 núcleos por mm² frente a la expresión débil (1+) en 424±109 núcleos por mm² en las áreas de cirrosis (p<0.001) (Figuras 2 y 3). Los controles mostraron un número de células positivas para PARP-1 de 1361.29±72.99 con intensidad (2+/3+) (Figura 4). Sólo el 4% de los HCC mostraron una intensidad nuclear débil para PARP-1 y un 96% intenso (3+). Inversamente, en las zonas peritumorales, correspondientes a nódulos regenerativos cirróticos, la expresión fue débil (1+) o ausente en el 86% y  moderada en 2 casos. No encontramos diferencias significativas de expresión de PARP-1 en función del grado de diferenciación del HCC (Figura 5).

Figura 1 - Expresión nuclear de PARP-1 intensa en más del 95% de las células de un HCC (Polimero conjugado con peroxidasa x 20)

Figura 2 - Expresión nuclear intensa en las células del HCC (derecha de la imagen) y negatividad en el nódulo cirrótico (izquierda de la imagen) (Polimero conjugado con peroxidasa x20). Control interno positivo; núcleos de linfocitos presentes entre los tractos de tejido fibrótico.

Figura 3 - Presencia de varios nódulos regenerativos en hígado cirrotico completamente negativos para PARP-1 junto adyacentes al HCC intensamente positivo para PARP-1 (ángulo inferior derecho) (Polímero conjugado con peroxidasa x10).

Figura 4 - Expresión nuclear moderada de PARP-1 en la mayoria de los hepatocitos en hígado no cirrótico. Control interno linfocitos en espacio porta (Polímero conjugado con peroxidasa 20x)

Figura 5A - Similar expresión de PARP-1 en número e intensidad en HCC bien (A) y moderadamente diferenciado (B) (Polímero conjugado con peroxida x20).

Figura 5B -

Discusión    

Ha sido sugerido que la acumulación de cambios genéticos conducen al desarrollo del HCC (8) y que los genes que regulan la respuesta ante el daño del ADN como PARP-1 juegan un importante papel en mantener la integridad genómica e intervienen en la patogénesis del HCC. Algunos estudios experimentales han indicado que la haplo-insuficiencia de Ku-80 en ratones Parp-1 -/-  promueve el desarrollo de adenomas y HCC (9), lo que sugiere que la deleción de PARP-1 está implicada en la patogénesis del HCC. Teóricamente, tras sufrir las células daño en el ADN es imperativo para la célula repararlo de manera correcta para retornar a su fenotipo normal.  Si el daño en el ADN no puede ser reparado completamente algunas células pueden sobrevivir como células transformadas (10).

En ciertas neoplasias ha sido observada  alta frecuencia de daño en el ADN y sobreactivación de PARP-1. En este contexto, PARP-1 tendría un papel protector frente al daño acumulativo del ADN en células tumorales y la activación de PARP-1 podría ser vital para la supervivencia de las células tumorales (11). Nuestros resultados, donde se demuestra la expresión moderada/intensa de PARP-1 en hepatocitos normales, la disminución o pérdida de expresión en hepatocitos en hígados cirróticos y la neoexpresión de PARP-1 con mayor intensidad en células neoplásicas del HCC apoyan esta teoría. Los hepatocitos normales estarían protegidos frente al daño del ADN al poder reparar las lesiones genotóxicas gracias a la presencia de PARP-1 y en la cirrosis la falta de este mecanismo protector permitiría el acúmulos de lesiones en el ADN y la transformación neoplásicas de las células teniendo un papel por tanto en el desarrollo patogénico del HCC, que sobreexpresaria PARP-1 como exponente del daño genómico.

Agradecimientos    

Bibliografía    

1. Okuda K. Hepatocellular carcinoma. J. Hepatol 32:225-237, 2000.
2. de Murcia G, and Menissier de Murcia J. Poly(ADP-ribose) polymerase: a molecular nick-sensor. Trends Biochem Sci 19: 172-176, 1994.
3. Tong WM, Ohgaki H, Huang H, Granier C, Kleihues P and Wang ZQ: Null mutation of DNA strand break-binding molecule poly-(ADP-ribose) polymerase causes medulloblastomas in p53(-/-)mice. Am J Pathol 162: 343-350, 2003.
4. Tong WM, Hande MP, Lansdorp PM and Wang ZQ: DNA strand break-sensing molecule poly(ADP-ribose) polymerase cooperates with p53 in telomere function, chromosome stability, and tumor suppression. Mol Cell Biol 21: 4046-4053, 2001.
5. Nomura F, Yaguchi M, Togawa A, et al: Enhancement of polyadenosine diphosphate-ribosylation in human hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 15: 529-535, 2000.
6.  Shiobara M, Miyazaki M, Ito H, et al: Enhanced polyadenosine diphosphate-ribosylation in cirrhotic liver and carcinoma tissues in patients with hepatocellular carcinoma. J Gastroenterol Hepatol 16: 338-344, 2001.
7. Wang ZQ, Huang ZY, Chen XP and Zhang ZF: The expression of Poly(ADP-ribose) polymerase and its biological significances in human hepatocellular carcinoma. World Chin J Dig 14: 1995-1998, 2006.
8. Suriawinata A and Xu R: An update on the molecular genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 24: 77-88, 2004.
9. Tong WM, Cortes U, Hande MP, et al: Synergistic role of Ku80 and poly(ADP-ribose) polymerase in suppressing chromosomal aberrations and liver cancer formation. Cancer Res 62: 6990-6995, 2002.
10. Sheng-Hui Huang, Min Xiong, Xiao-Ping Chen, Zhen-Yu Xiao, Yin-Feng Zhao, Zhi-Yong Huang. PJ34, an inhibitor of PARP-1, suppresses cell growth and enhances the suppressive effects of cisplatin in liver cancer cells. Oncology Reports 20: 567-572, 2008.
11. Suriawinata A and Xu R: An update on the molecular genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Liver Dis 24: 77-88, 2004.

Comentarios

- MARIA GARCIA MARTOS - ESPAÑA  (25/11/2009 15:26:32)

Un trabajo interesantisimo y muy docente. Muchas gracias

- Rafael Esteban Carvia Ponsaillé - ESPAÑA  (25/11/2009 18:56:40)

Estimados Paco, Trini y Raimundo: felicitaciones por vuestro trabajo. Un saludo.

- Casilda Lafuente Nalda - ESPAÑA  (27/11/2009 20:34:00)

comunicación muy interesante