Direccion de contacto Dra Violeta Aragón C. aragonvioleta@yahoo.es
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Evaluación de la marcación de TTF-1 y tiroglobulina mediante la técnica de inmunohistoquímica para la determinación de la data de muerte
Violeta Aragón Carrasco[1], Ignacio Gutiérrez Mejía[1], Julia Jiménez Reyes[1]
(1) Servicio de Anatomia Patologica Instituto de Medicina Legal PERU
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La determinación de la data de muerte es un paso importante en el estudio forense, se hace más difícil mientras mas tiempo transcurra entre el hallazgo del cuerpo y la autopsia. El desarrollo de técnicas inmunohistoquimicas está en desarrollo para poder delimitar la data de muerte en tejidos en putrefacción
Objetivo: Evaluar las características de inmunomarcacion de tiroglobulina y TTF1 en tejido tiroideo en diferentes datas de muerte
Material y Métodos: Estudio descriptivo, prospectivo; Fragmento de tejido tiroideo a temperatura y humedad ambientales (24ºC y 80%). Toma de muestras consecutivas durante 14 días en intervalos uniformes de 24 hr. Proceso de coloración: hematoxilina-eosina e inmunohistoquímica con los anticuerpos tiroglobulina y TTF1.
Resultados:
A partir del día 6 se hace evidente el incremento de la basofilia nuclear y de la eosinofilia citoplasmática, la retracción del coloide se hace más evidente a partir del día 13. El porcentaje de marcación nuclear y de la intensidad con TTF1 disminuye progresivamente siendo ausente a partir del día 7 post mortem. La tiroblogulina muestra una marcación estable durante todo el período de estudio.
Conclusiones:
TTF1 es un marcador confiable para delimitar la data de muerte, ya que su ausencia se presenta a partir del día 7 por lo que se asumiría que el cadáver tiene mas de 7 días post mortem
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Introducción
El establecimiento de la data de muerte es un paso importante en el estudio forense. Es un proceso complejo debido a los múltiples factores que interviene en los cambios post mortem ya que estos varían de acuerdo a factores intrínsecos (edad, sexo, la actividad física previa al suceso) y factores extrínsecos (humedad temperatura insectos etc.)
Es mucho mas difícil determinar la data de muerte mientras mas tiempo haya transcurrido entre el deceso y la fecha de la necropsia, ya cuando los procesos de autolisis y putrefacción se han iniciado, por lo que se han estudiando diversos métodos para la determinación de la data de muerte, que al emplearlos en conjunto acercan y validan aun mas la aproximación a la data de muerte. Los parámetros que se utilizan son fisiológicos(ejm rigor mortis), físicos(insectos) y bioquímicos( inmuhistoquimica)
La Inmunohistoquimica es un método sensible, que se basa en el empleo de anticuerpos específicos que marcan partes especificas del tejido (antigeno) y la tinción varia de acuerdo a varios factore1 entre ellos el fenómeno de autolisis y putrefaccion hace que se pierdan paulatinamente antigenos que ya no marcaran,2 esta propiedad puede ser utilizada para determinar el tiempo de muerte al determinar en cuanto tiempo desaparecen dichos antigenos. Para este fin se realizara el presente estudio empleando dos marcadores (tiroglobulina y TTF1), evaluando la inmunomarcación en diferentes días post mortem.
Se ha empleado el método de inmunohistoquimica como método alternativo de cronotanatodiagnóstico 3 4, pero no hay reportes del uso de TTF1. Se selecciono la tiroides por que al ser un órgano de fácil acceso quirúrgico y estar alejado de cavidades u órganos que aceleren su descomposición.
TTF1 es una proteína nuclear de 38 KDa, es un factor de trascripción específico de los genes tiroideos que regulan la producción de tiroglobulina y tiroperoxidasa. También se expresa en pulmón y en diencefalo. La tinción es nuclear.
La tiroglobulina es una glicoproteína sintetizada exclusivamente por las células foliculares tiroideas, y constituye 75% del contenido proteico de la glándula tiroides. A su vez, es el precursor para la síntesis de hormonas tiroideas. Las células marcadas con el anticuerpo muestran la tinción a nivel del lumen de los folículos tiroideos y la superficie apical de los tirocitos.5
En el presente estudio evaluamos las características histológicas (eosinofilia citoplasmática, basofilia nuclear, cariorexis y retracción del coloide) y a la vez comparamos la intensidad y porcentaje de la inmunomarcación mediante tiroglobulina y TTF-1 durante 14 días post mortemFigura 1.
Los resultados permitirán de una manera confiable determinar el tiempo post mortem, estos resultados preliminares esperan ser ampliados con el fin de validar definitivamente el método.
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Material y Métodos
Estudio de tipo prospectivo, descriptivo, experimental.
Espécimen tisular
Se tomo muestra de la glándula tiroides procedente de cadáver de 19 años sin patología tiroidea ni enfermedad sistémica crónica, durante la realización de una necropsia medico legal, al momento de la misma, el cadáver tenía un tiempo de muerte de 8 horas.
El fragmento de tiroides se deja en recipiente de vidrio, a temperatura del ambiente, (temperatura promedio de 25 ºC) con una humedad promedio de 80 %, a nivel del mar, sobre gasa húmeda para evitar la desecación.
Fijación
Se toman muestras seriadas de 4x4x4 mm a partir de las 8 horas y continuando a las 12 hr. , 24 hr. , 2 días, 3 días hasta concluir con el 14 día post mortem; fijándolos en formol al 10%.a un ph4.
Procedimiento del espécimen
Se procesaron los cortes en Technicon durante 12 horas empleándose el método de rutina con alcohol y xilol al final se incluyeron las muestras en parafina y se obtuvieron cortes de 3 um de espesor.
Coloración e inmunohistoquimica
Se procedió a colorear mediante Autostainer Leica con Hematoxilina Eosina. Evaluándose la presencia o ausencia de las características citológicas, su intensidad se graduó mediante el empleo de una escala histológica, siendo 0 la ausencia y 3 la mayor intensidad.
A su vez, se obtuvo cortes para los estudios de Inmunohistoquimica mediante el método de la reacción antígeno-anticuerpo se utilizó el sistema biotina- streptoavidina-peroxidasa empleándose como cromógeno 3,3 diaminobencidina (DAB) . En esta evaluación Inmunohistoquimica se opto por los anticuerpos de Tiroglobulina y TTF-1 ambos de Dako.
Esta técnica inmunoenzimática se basa en la alta afinidad que tiene la avidina, una glicoproteína básica, por la vitamina biotina, que es más de cien mil veces superior que la de un anticuerpo por su antígeno 1. Esta propiedad permite mejorar la intensidad del marcaje al amplificar la reacción. Después de la incubación del tejido con el anticuerpo primario, se aplica un anticuerpo secundario ligado a una molécula de biotina. Posteriormente, se incuba con un complejo constituído por moléculas de avidina y biotina conjugadas con peroxidasa, en el cual debe predominar la avidina (4:1) para que pueda unirse a las moléculas de biotina que se encuentran ligadas al anticuerpo secundario.
Así, se obtienen varias moléculas de enzima por locus antigénico, ofreciendo por lo tanto, una excelente calidad de marcaje,
Una variante de este método es la que utiliza estreptavidina, una proteína formada por cuatro subunidades idénticas que se pueden unir cada una a una biotina. Algunos autores afirman que este cambio puede reducir el marcaje inespecífico
Al utilizar dichos marcadores se permite cubrir la zona citoplasmática (tiroglobulina) y nuclear (TTF-1); y considerándose como control externo muestra de tiroides de paciente vivo, se gradúa la intensidad en cruces siendo (-) nulo; (3+) la mayor intensidad y el porcentaje (se medirá en 4 campos de gran aumento contándose 100 núcleos y obteniéndose el promedio)
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Resultados
Se evaluaron 14 cortes de parafina correspondientes a cada día post mortem procesado mediante técnicas de IHQ para que marque TTF1 y Tiroglobulina.
Tabla 1.- Secuencia de evaluacion de las caracteristicas histologicas en tiroides segun el dia post morten.Mediante la escala histologica 0 ¡gual a ausente. 3 maxima expresion.
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Eosinofilia |
Basofilia |
Retraccion citoplasmatica |
Retracion coloide |
Cariorexis |
Picnosis |
12 hr |
0,5 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
24 hr |
0,5 |
1 |
0,5 |
0,5 |
0 |
1 |
36 hr |
0,5 |
1 |
1 |
0,5 |
0 |
1 |
3d |
0,5 |
1 |
1 |
0,5 |
0 |
1 |
4d |
0,5 |
2 |
1 |
0,5 |
0 |
1 |
5d |
0 |
2 |
1 |
1 |
0 |
1 |
6d |
0 |
2 |
1 |
1 |
1 |
2 |
7d |
0 |
2 |
1 |
1 |
1 |
2 |
8d |
0 |
2 |
1 |
1 |
1 |
2 |
9d |
0 |
2 |
1 |
1 |
1 |
2 |
10d |
0 |
2 |
1 |
1 |
1 |
2 |
11d |
0 |
2 |
1 |
1 |
1 |
2 |
12d |
0 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
13d |
0 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
14d |
0 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
15d |
0 |
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
En la Figura 2, a la evaluación microscópica se encontró que la eosinofilia citoplasmática va disminuyendo a partir del día 4 post mortem, y que la basofilia nuclear aumenta progresivamente y sostenidamente desde el 5 día post mortem.
En la Figura 3, la retracción citoplasmática y la retracción del coloide se van incrementando, la primera a partir del día 3 y la segunda a partir del día 6 post mortem.
La desintegración del núcleo (cariorexis) aunque se expresa sutil se incrementa a partir del día 7 al igual que el incremento de la picnosis nuclear.
Con la tincion inmunohistoquimica podemos apreciar que el porcentaje de células foliculares con tinción positiva para TTF-1 se mantiene uniforme hasta el dia 6 y de ahi va decreciendo, siendo nula a partir del día 7 post mortem.
Tabla 2.- Porcentaje e intensidad de marcacion de TTF1 mediante inmunohistoquimica segun dia post morten.
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Porcentaje |
Intensidad |
36 hr |
80 |
1 |
3d |
80 |
2 |
4d |
70 |
2 |
5d |
80 |
2 |
6d |
50 |
2 |
7d |
0 |
0 |
8d |
0 |
0 |
9d |
0 |
0 |
10d |
0 |
0 |
11d |
0 |
0 |
12d |
0 |
0 |
13d |
0 |
0 |
14d |
0 |
0 |
15d |
0 |
0 |
Figura 1.-HE 40x: Primera muestra de tiroides a las 6 hr post morten se observan celulas cúbicas del foliculo tiroideo con su alineacion pericoloidal y las caracteristicas nucleares y citologicas sin alteraciones. Presencia conservada de vacuolas intracoloidales
Figura 2.- HE 100x: Resalta la basofilia y retraccion nuclear, y eosinofilia citoplasmatica; ademas la perdida de la delimitacion y la forma cubica de las celulas del foliculo,con la respectiva alteracion arquitectural del mismo.Todo en el dia 7 del proceso en estudio
Figura 3.- HE 40x: Retracción de coloide, aqui en el día 13, asi como picnosis nuclear y alteracion de la arquitectura.
Figura 4 . Tincion inmunohistoquímica de TTF1. 10x (8-12 horas del estudio) Intensa tincion nuclear en mas del 80 % de las celulas foliculares
Figura 5.- TTF1 10x. Positividad nuclear en las celulas foliculares (5 dia)- Se observa descenso de la intensidad y del porcentaje de nucleos marcados.
Figura 6.-TTF1 40x. Positividad nuclear en las celulas foliculares (6 dia)
Figura 7.-TTF1 40x .Negativo (7 día) Ausencia de tincion a partir del dia 7.
Figura 8.-Tiroglobulina 10x. Marcacion positiva homogenea en citoplasma celular y coloide. (9 días)
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Discusión
La determinación del tiempo de muerte siempre ha constituido un desafió en la practica de la medicina legal, quedando muchas veces como imprecisable por el avanzado estado de autolisis y putrefacción en que es encontrado el cadáver.
Los métodos de inmunohistoquimica nos permiten marcar con anticuerpos clonales un tipo especifico de antigeno , mediante este estudio evaluaremos de manera indirecta la perdida de estos antígenos a través de los días; hay algunos antigenos que son mas resistentes a la desintegración post mortem que otros por ejemplo la insulina en células pancreáticas esta presente hasta 30 días en tejido post mortem aunque la mayoría como proteínas de filamentos intermedios, antigenos epiteliales, hormonas y factor VIII marcan de manera confiable hasta 3 días post morten2 por lo que Knudsen concluye que la inmunohistoquimica puede ser empleada para resolver problemas diagnósticos en muestras obtenidas de autopsias
Son pocos los estudios referentes al empleo de técnicas de inmunohistoquimica para la determinación del tiempo de muerte. Wehner3,4 empleo varios marcadores para este propósito encontrando que la tiroglobulina mostraba ser un marcador confiable siendo su marcación nula a partir del día 13. En nuestro trabajo evidenciamos que la marcación permaneció constante durante todo el periodo de estudio (14 días), esta diferencia aunque sutil podría deberse al empleo de diferente clona de anticuerpo o técnica inmunohistoquimica a la empleada por nosotros.Figura 8
En cuanto al marcador TTF-1, sorprendentemente el marcaje nuclear fue intenso hasta el día 6, el hecho que la marcación sea negativa a partir del día 7 nos lleva a inferir que el cadáver tiene por lo menos hasta 6 días de tiempo de muerte, sin embargo esta negatividad podría darse antes si las condiciones del cadáver variarían a las examinadas en el presente estudio.Tabla 2
Los cambios citológicos no han sido descritos en trabajos anteriores, De Jongh8 hace un estudio histológico post mortem de tiroides comparado sujetos sanos con enfermos crónicos, encontrando que la disminución del tamaño de los folículos se encuentra en personas con enfermedades crónicas y no es un fenómeno de autolisis, en nuestro estudio encontramos que los cambios nucleares (picnosis y cariorexis) son mas evidentes que los cambios citoplasmáticos aunque la diferencia entre los diferentes periodos de tiempo no son muy marcados por lo que su evaluación es mas difícil y poco reproducible.
El TTF 1 se muestra como un marcador útil y confiable para determinar tiempo de muerte, ya que su ausencia en porcentualidad y marcación de intensidad se presenta a partir del día 7
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Conclusiones
El anticuerpo TTF1 se muestra como un marcador confiable que podria determinar tiempo de muerte en tejido en estado de putrefacción , ya que su ausencia se presenta a partir del día 7 por lo que se asumiría que el cadáver tiene mas de 7 días post mortem.
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Agradecimientos
Agradecemos a nuestra Institucion y en forma muy especial a la Morgue Central de Lima-Peru
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Bibliografía
1 - Dabbs D. Diagnostic Immunohistochemistry. Churchill Livingstone; 2 Ed.2006.
2 - Knudsen LM, Pallesen G.The preservation and loss of various non-haematopoietic antigens in human post-mortem tissues as demonstrated by monoclonal antibody immunohistological staining.Histopathology. 1986 Oct;10(10):10
3 - Wehner F, Wehner HD. Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of thyroglobulin For Sci Intern 2000 ;110(3):199-206
4 - Wehner F, Wehner HD, Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of calcitonin. For Sci Intern 2001;122 (2): 89-94
5 - Dako.Polyclonal Rabbit Anti-Human Thyroglobulin Code No./ Code/ Code-Nr. A 0251
Edition/ Ausgabe 01.12.02 .Disponible en : www.dako.co.uk/prod_downloadpackageinsert.pdf?objectid=102358001
6 -A. GISBERT,Medicina Legal y Toxicologia,4ta edicion,Capitulo 19, pag 159 a 160.
7 -LESLIE GARTNER,JAMES HIATT;Texto Atlas de Histologia, 3era Ediciòn, capitulo 13,pag 311a 316.
8 - De Jongh FE .Thyroid morphology in letal non-thyroidal illness: a post mortem study. Eur Jou Endo. (2001)144: 221-226
9 -Wehner F,Wehner HD,Schieffer MC,Subk J Delimitation of the time of death by immunohistochemical detection of insulin in pancreatic β-cells.For Sci Intern 1999.105(3):161-169
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Comentarios
- Israel Bernal - ESPAÑA (04/11/2009 10:34:56)
Los felicito por el trabajo, es un área poco investigada y que seria de gran ayuda en los estudios forenses. Seria interesante hacer el estudio en mas de un cadáver para tener puntos de comparación y variaciones dentro del estudio que le darían mas valor, me gustaría saber si se han planteado el hecho de que extraer el órgano solo, en este caso el tiroides, ¿no afecta el proceso de descomposición tisular acelerado por otros tejidos como el digestivo? evento un poco dificil de sortear ya que no se podria mantener un cadaver completo en proceso de putrefaccion para el estudio.
- Fernando Garcia - MEJICO (08/11/2009 1:41:06)
Felicidades por su trabajo. Considero que el proceso de inmunohistoquimica nos abre un campo grande de estudio en el cronotanatodiagnostico.
- Daniel Sanchez Guerra - ESPAÑA (10/11/2009 22:34:27)
felicitaciones una herramiente muy util
- Marta M. Mayorga Fernández - ESPAÑA (11/11/2009 10:54:40)
Es un trabajo muy curioso e interesante. Además útil para el campo forense.
Supongo que con el estudio de distintas variables como la localización del cadaver, forma de muerte, temperaturas, etc... mostrará cambios en estas tinciones por la pérdida de antígenos y esas cosas. ¿Se hizo recuperación de antígenos en la técnica? Es muy interesante.
- Manuel López Alcaraz - ESPAÑA (12/11/2009 18:53:13)
Estimados compañeros:
Una línea de investigación tremendamente interesante. Al hilo de lo que comentaba Israel Bernal, estoy de acuerdo en que hay que ser cautos a la hora de evaluar los resultados, ya no sólo por la escasez de la muestra, sino también por la falta de condiciones reales (hoy por hoy, ni siquiera Bass, controlando cada variable en el cadáver ha sido capaz de encontrar un parámetro de evolución homogénea) y ya no sólo por el papel del tubo digestivo, sino otros muchas variables como infecciones locales o generalizadas, tumores (y...) e incluso la propia congestión tiroidea, tan marcada en procesos asfícticos (cualquiera que sea su etiología) o de origen cardíaco. Sin olvidar en qué medida puede afectar el hiper o el hipotiroidismo en la cuantificación de tiroglobulina.
Un buen comienzo.
Manuel López Alcaraz
- FRANCISCO JOSE MAZORRA MACHO - ESPAÑA (16/11/2009 12:41:29)
Otro ejemplo más de que la inmunohistoquímica puede dar de sí más de lo que parece.
- Mª ELENA COS CORRAL - ESPAÑA (18/11/2009 16:55:17)
Estos estudios son muy interesantes desde el punto de vista medico-forense, conocer el momento de la muerte puede representar el éxito o el fracaso de una investigacion policial en el esclarecimiento de una muerte. Muy útil.
- Joan Francesc Garcia Fontgivell - ESPAÑA (20/11/2009 20:47:28)
Un uso de la inmunohitoquimica que hasta ahora no conocia.
Muy intresante
- FRANCISCO JAVIER TAPIA CHINCHÓN - ESPAÑA (22/11/2009 15:26:23)
Un trabajo que abre los ojos, excelente.
Completamente de acuerdo con Israel Bernal.
- Marta Grijalba Mazo - ESPAÑA (23/11/2009 16:57:47)
Felicidades por vuestro trabajo, exposición y estímulo a la investigación en un campo, el de el cronotanatodiagnóstico, tan complejo y poco estudiado. Gracias.
- María Jesús Coma del Corral - ESPAÑA (27/11/2009 11:47:18)
Las fotos son espectaculares!
- Ana María García Blanco - ESPAÑA (27/11/2009 19:03:36)
Un trabajo que abre una línea de investigación muy útil para la dificil tarea de la determinación de la data de la muerte. Muy interesante.
- Azahara Martinez López - ESPAÑA (28/11/2009 20:04:11)
Muy interesante...Desconocía que la inmunohistoquímica pudiese llegar a servir de herramienta para determinar la data de la muerte
- Mirta García Jardón - REPUBLICA SUDAFRICANA (29/11/2009 16:37:03)
Los felicito, por un trabajo tan interesante, muy valioso, a pesar de ser un estudio experimental. No estoy muy familiar con los costos y precios de esas pruebas, quisiera saber si ello encarecería mucho la autopsia (ya se que por ser forense es estatal, pero se cobra igual). En patología forense yo creo que esa determinaci ón de la data de muerte es una de las cosas vitales de vuestro trabajo. Un trabajo muy bueno e interesante.
- Izaskun Mallaviabarrena - ESPAÑA (30/11/2009 19:33:48)
Trabajo muy interesante y novedoso, al menos para mí. Felicidades
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